乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA和松弛环状DNA耐药突变检测及比较

【摘要】  目的  建立检测乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（cccDNA）逆转录酶区（RT）耐药位点的方法，并分析HBV cccDNA与松弛环状DNA（rcDNA）RT区耐药位点及耐药突变率的差异。 方法  利用滚环扩增法(RCA)同时扩增20例慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA和HBV载量为108拷贝/ml血清中的rcDNA，再以该扩增产物为模板，以跨缺口引物扩增HBV cccDNA和HBV rcDNA RT区；巢式PCR直接扩增同一患者血清中HBV rcDNA RT区。HBV cccDNA和HBV rcDNA RT区扩增片段经测序后采用Vector NTI Suite8.0及chromaslite201分析其耐药突变位点；采用χ2检验比较rcDNA和cccDNA RT区的耐药突变率。 结果  以RCA产物为模板用跨缺口引物成功扩增并获得肝组织cccDNA RT区片段，阴性对照组及HBV载量为108拷贝/ml血清rcDNA组均无扩增产物；巢式PCR直接扩增获得同一患者血清中HBV rcDNA RT区片段。序列测定结果显示，本组试验中10例有抗病毒史的慢性乙型肝炎患者发生rcDNA RT区耐药者有6例，突变率为60%，1例发生cccDNA RT区突变，突变率为10%，两者比较，P＝0.019，差异有统计学意义。10例无抗病毒史的慢性乙型肝炎患者有2例发生rcDNA耐药，耐药突变率为20%，1例发生cccDNA耐药突变，突变率为10%，两者比较，P＝0.531，差异无统计学意义。产生耐药突变的患者其cccDNA与rcDNA RT区耐药突变位点均不相同。 结论  RCA可用于HBV cccDNA RT区耐药突变位点检测；有抗病毒史的患者的rcDNA与cccDNA RT区耐药突变不同步。在辅助临床治疗中，对HBV cccDNA进行耐药监测比对HBV rcDNA耐药监测更有意义。

【关键词】  肝炎病毒, 乙型;  肝炎，乙型，慢性； 抗药性； 滚环扩增法

Comparative analysis of drug resistant mutations in the reverse transcriptase domain of hepatitis B virus covalently closed circular DNA and the viral relax circle DNA    SU He-ling* , LIU Yong-ming, REN Xiao-qiang, XU Dong-ping, ZHONG Yan-wei. *College of Biotechnology, Guilin Medical University, Guilin 541004, China

Corresponding author: XU Dong-ping, Email: xudongping@ yahoo.com, PLA Institute of Infectious Diseases, PLA 302 Hospital, Beijing 100039, China

Co-corresponding author: ZHONG Yan-wei, Email: zhongyanwei@ 126.com

【Abstract】 Objective    To establish a method for detection of reverse transcriptase region of hepatitis B virus (HBV) covalently closed circular DNA (cccDNA), and to compare the pattern and frequency of drug-resistant mutations in the region between intrahepatic HBV cccDNA and serum HBV relax circle DNA (rcDNA).  Methods    HBV DNA were extracted from liver biopsy tissues of 20 patients with chronic hepatitis B. The RT region of HBV cccDNA was amplified by rolling circle amplification (RCA) followed by polymerase chain reaction (PCR) mediated by a pair of primers spanning across the gap region of HBV genome. The RT region of serum HBV rcDNA from the same patient was amplified by nested-PCR. The PCR products were directly sequenced and analyzed by Vector NTI Suite8.0and chromaslite201 software. X2 test was used for statistical significance analysis of drug-resistant mutation occurrences between the HBV cccDNA and rcDNA. Results    The RT regions of HBV cccDNA were successfully amplified from liver tissues of all enrolled patients using the RCA plus PCR assay. Simultaneously, HBV the RT regions of rcDNA were amplified from these patients serum samples. Sequence analysis showed that the drug-resistant mutations were significantly more frequently detected in HBV rcDNA (40%) than in HBV cccDNA (10%) (P < 0.05). Different mutational patterns were observed between the HBV cccDNA and rcDNA in a few cases. Conclusion    The RCA in combination with PCR is a practical method for the detection of drug-resistant mutation in the RT region of HBV cccDNA. Drug-resistant mutational patterns could be discrepant between HBV cccDNA and rcDNA.

【Key words】Hepatitis B virus; Hepatitis B, chronic; Drug resistance; Rolling cycle amplification

共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）可作为乙型肝炎病毒（HBV）复制的重要指标。目前国内外主要利用荧光定量PCR检测HBV cccDNA拷贝数，而关于HBV cccDNA逆转录酶（reverse transcriptase，RT）区耐药位点突变的研究较少。滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）法优势扩增环形DNA模板，而对线性、松弛环状DNA（relax circle DNA，rcDNA）模板的扩增效率极低[1]，因此，RCA是检测HBV cccDNA的有力手段，本组试验利用RCA建立检测C基因型HBV cccDNA RT区耐药突变位点的方法，并通过与rcDNA RT区耐药突变情况的比对，分析HBV复制与耐药的关系。

资料与方法

1．主要试剂：肝组织中HBV cccDNA的提取采用德国Qiagen公司QIAamp DNA Micro试剂盒；血清中HBV DNA的提取采用四川天泽基因工程有限公司DNAout试剂盒；PCR试剂盒购自四川天泽基因工程有限公司；克隆测序由北京天一辉远生物公司完成；phi29 DNA聚合酶购自英国New England Biolabs公司；不降解质粒的三磷酸腺苷依赖DNA酶（Plasmid-Safe ATP-dependent DNase, PSAD）购自美国Epicentre Technologies公司；引物由上海生物工程公司合成。

2．研究对象：20份肝组织标本及血清来自解放军第三O二医院就诊和治疗的慢性乙型肝炎患者(10例有抗病毒史，10例无抗病毒史)。患者诊断均符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》慢性乙型肝炎的诊断标准[2]。肝组织标本于液氮中保存，血清样品于-40℃保存。

3．HBV rcDNA提取及cccDNA的酶切处理：按说明书的操作步骤，分别从20份肝组织标本及血清中提取HBV DNA。取5μl肝组织中提取的HBV DNA，加2μl 10×PSAD缓冲液，0.8μl 三磷酸腺苷（25mmol/L），1μl PSAD (10U/μl)，去离子水11.2μl。混匀后置37℃水浴酶切1h备用。

4．滚环扩增HBV cccDNA及rcDNA：以HBV高度保守区域分别设计8条引物，其中4条与HBV cccDNA正链互补，其余4条与HBV cccDNA负链互补。引物序列见表1，引物末端2个碱基均硫化。以PSAD酶消化后的肝组织HBV cccDNA、HBV载量为108拷贝/ml 血清rcDNA、去离子水为模板分别进行RCA反应，反应条件参照文献[3]进行。

表1  RCA引物序列一览表

引物名称       序列           位置

RCA1     5′-AATCCTCACAATA*C*C-3′      nt226～ nt240

RCA2     5′-GATGGGATGGGAA*T*A-3′     nt615～ nt601

RCA3     5′-CCTATGGGAGTGG*G*C-3′     nt637～ nt651

RCA4     5′-GCAACGGGGTAAA*G*G-3′   nt1154～nt1140

RCA5     5′-ATGCAACTTTTTC*A*C-3′       nt1814～nt1828

RCA6     5′-TCCAAATTCTTTA*T*A-3′       nt1930～nt1916

RCA7     5′-TAGAAGAAGAACT*C*C-3′    nt2368～nt2682

RCA8     5′-AGAATATGGTGAC*C*C-3′      nt2828～nt2814

  注：RCA：滚环扩增；*为硫代修饰碱基

5．rcDNA及cccDNA RT区PCR扩增及测序结果分析：取1μl上述滚环扩增产物为模板，以跨缺口引物（5′-ATCCGCAGGCCATGCAGTGG-3′; 5′-AGTAACTCCACAGAAGCTCC-3′）扩增cccDNA，扩增长度为1948 bp。以血清HBV DNA为模板，利用巢式PCR扩增RT区，具体引物、PCR体系及扩增条件参照文献[4]进行。反应条件为：94℃ 3min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 120s，35个循环，72℃ 10min。PCR产物测序后，结果用Vector NTI Suite8.0及Chromaslite201分析，如测序峰图中同一位点有2个峰存在，且低峰的高度达高峰的25%，则认为存在核苷酸共存现象。

6．统计学分析：rcDNA和cccDNA RT区的耐药突变率比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. 滚环扩增结果：滚环扩增后，HBV cccDNA组、rcDNA组及阴性对照组均扩增出大于10000bp的产物（图略）。取1μl RCA产物为模板，以跨缺口引物扩增HBV cccDNA及rcDNA RT区，结果显示，阴性对照组及rcDNA组无扩增条带（图略），HBV cccDNA组扩增产物大小（1948bp）与预期相符。用巢式PCR扩增HBV rcDNA 的RT区片段，扩增片段大小（1225bp）与预期相符，阴性对照组无条带（图略）。扩增产物均送测序。

2. HBV cccDNA、rcDNA RT区耐药位点分析：分析测序峰图，重点检测V173、L180、M204等14个核苷酸类似物耐药位点。在1～10号有抗病毒用药史的慢性乙型肝炎患者中，4、5、7、8号患者血清中HBV rcDNA RT区出现拉米夫定耐药突变，而肝组织中HBV cccDNA RT区为野生型。2号患者cccDNA RT区耐药突变类型为L80L/I+ V173M/L+L180M+M204I/M/V，而rcDNA为L80I+V173M/L+L180L/M+M204M/V。3号患者cccDNA RT区突变类型为L80I，此位点突变并不能使HBV对核苷（酸）类似物产生耐药，但同一患者rcDNA RT区突变类型为L80L/I+V173M+ M204I/M/V联合突变形式，在拉米夫定耐药位点M204I/M/V存在的基础上，联合L80L/I+V173M突变可回复HBV的复制力。在11～20号无抗病毒用药史的慢性乙型肝炎患者中，11、17号患者rcDNA RT区出现耐药突变，而肝组织中cccDNA RT区为野生型，16号患者肝组织中cccDNA RT区出现耐药突变，而rcDNA RT区为野生型。cccDNA和rcDNA RT区耐药突变类型，具有明显的差异，见表2。

表2  患者HBV cccDNA与HBV rcDNA RT区

耐药突变位点

患者编号       cccDNA RT区耐药位点     rcDNA RT区耐药位点

 1    野生       野生

 2    L80L/I+V173M/L+ L80I+V173M/L+

         L180M+M204I/M/V    L180L/M+M204M/V

 3    L80I（野生）a      L80L/I+V173M+

                M204I/M/V

 4    野生       M204I

 5    野生       T184S

 6    野生       野生

 7    野生       A181A/V

 8    野生       V173L+L180M+M204V

 9    野生       野生

10    野生       野生

11    野生       V173L+L180M+M204M/V

12    野生       野生

13    野生       野生

14    野生       野生

15    野生       野生

16    L80L/I+L180L/M+

         M204M/V/I 野生

17    野生       A181A/V

18    野生       野生

19    野生       野生

20    野生       野生

  注：1～10号为慢性乙型肝炎患者有抗病毒用药史；11～20号为慢性乙型肝炎患者无抗病毒用药史；a：L80I位点单独存在对HBV的耐药无影响，但联合M204、L180位点突变可使此突变株HBV复制力回复

3. HBV rcDNA和cccDNA RT区的耐药突变率比较：在20例慢性乙型肝炎患者中，有8例发生血清HBV rcDNA RT区耐药突变，突变率为40%，肝组织HBV cccDNA发生耐药突变2例，突变率为10%；血清HBV rcDNA RT区的耐药突变率高于cccDNA，P＝0.028，差异有统计学意义。10例有抗病毒史的慢性乙型肝炎患者发生rcDNA RT区耐药者有6例，突变率为60%，1例发生cccDNA rcDNA，突变率为10%，两者比较，P＝0.019，差异有统计学意义。10例无抗病毒史的慢性乙型肝炎患者中有2例发生rcDNA耐药，耐药突变率为20%，1例发生cccDNA耐药突变，突变率为10%，两者比较，P＝0.531，差异无统计学意义。

讨    论

经典的跨双缺口PCR检测cccDNA策略沿用已久，用数学模型评估和实时荧光定量PCR方法验证，跨双缺口方法中rcDNA丰度必须低于103拷贝/ml，PCR反应才能有效避免假阳性的发生。单独应用Hirt分离法或选择性酶切方法并不能确保rcDNA丰度降至假阳性阈值以下[5]。RCA利用噬菌体phi 29 DNA聚合酶具有DNA链取代作用的特性，以待测物环状的DNA作为模板，相应的引物结合到模板上，在恒温下滚环式迅速扩增待测物环状DNA，最近有人用RCA扩增各种环形DNA分子[6-7]。由于RCA对环形DNA的特异性扩增，可充分区分HBV cccDNA与rcDNA，保证cccDNA扩增的特异性，这为HBV cccDNA检测提供了新的科研思路[8]。中国感染HBV的人群主要为C基因型，我们针对C基因型HBV高度保守区设计8条引物，扩增HBV cccDNA及HBV rcDNA，再以RCA产物扩增cccDNA及rcDNA的RT区，结果显示，HBV cccDNA RT区有扩增条带而rcDNA无扩增条带，表明扩增的HBV cccDNA RT区不含rcDNA RT区片段。该试验为检测cccDNA RT区耐药位点奠定了基础。

HBV cccDNA RT区片段及巢式PCR扩增的rcDNA RT区片段测序后，其耐药位点分析结果显示，同一患者cccDNA和rcDNA RT区耐药突变类型具有明显的差异，且血清rcDNA RT区的耐药突变率（40%）明显高于cccDNA（10%），有抗病毒用药史的慢性乙型肝炎患者其血清rcDNA RT区耐药突变率（60%）高于cccDNA（10%），差异有统计学意义。该结果可能与核苷类药物只能干预细胞质内前基因组RNA逆转录形成病毒DNA负链和以负链为模板进行正链延伸的过程，而对cccDNA无直接作用有关。在无抗病毒用药史的慢性乙型肝炎患者中，虽然rcDNA RT区耐药突变率高于cccDNA，但差异无统计学意义。可能是由于在无抗病毒药物治疗患者体内，无核苷（酸）药物作为选择压力，rcDNA及cccDNA RT区耐药突变是随机产生的，或是感染HBV耐药株产生的，因此，rcDNA及cccDNA RT区耐药突变率差异无统计学意义。

尽管HBV cccDNA的存在是HBV难以被清除的重要原因，也是停止抗病毒治疗后乙型肝炎复发的分子基础，但目前国内外HBV耐药的研究主要集中在患者血清中HBV rcDNA的耐药突变上，关于HBV cccDNA RT区耐药突变的报道很少。本组试验采用RCA法扩增HBV cccDNA，并以RCA产物为模板成功扩增不含rcDNA 的cccDNA RT区片段，从而获得患者HBV cccDNA RT区的耐药突变情况。该试验结果为抗病毒治疗中出现病毒耐药提供了理论依据。有些患者血清中rcDNA出现耐药突变而并未出现HBV DNA反跳或耐药株病毒未成为优势株，可能与其肝细胞中绝大多数cccDNA RT区仍为野生型有关。因此，在辅助临床治疗中，对HBV cccDNA进行耐药监测比对HBV rcDNA耐药监测更有意义。但患者肝组织标本较难获得，建立血清中检测HBV cccDNA RT区耐药突变的方法成为今后的研究方向之一。    

参  考  文  献

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（收稿日期：2010-03-09）

（本文编辑：袁平戈）

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