沉默结缔组织生长因子对大鼠肝纤维化的影响

【摘要】  目的  研究结缔组织生长因子（CTGF）小干扰RNA（siRNA）在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中的抗肝纤维化作用及其对肝星状细胞（HSC）激活的影响。 方法  雄性SD大鼠24只，随机分成4组。模型组：皮下注射CCl4及经门静脉注射等渗盐水，每3d 1次，连续6周（给药频率与时间，下同）；CTGF siRNA干预组：皮下注射CCl4及经门静脉注射CTGF siRNA；对照siRNA干预组：皮下注射CCl4及经门静脉注射对照siRNA；正常对照组：经门静脉注射等渗盐水。用HE染色和Sirius red染色评估大鼠肝组织学变化, Western blot检测肝组织CTGF及α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，免疫组织化学染色评估肝组织α-SMA阳性细胞数量。对实验数据用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验分析。 结果  模型组及对照siRNA组大鼠肝组织CTGF及α-SMA蛋白表达显著上调，α-SMA染色阳性细胞数量明显增加。与模型组相比, CTGF siRNA组CTGF及α-SMA蛋白表达分别下调95%±2%和86%±11%（F值分别为21.234和12.473, P值均<0.01）；肝组织α-SMA染色阳性细胞数减少76%±9%（F＝9.179, P<0.01）；组织学检查显示肝纤维化程度明显减轻。 结论  siRNA沉默CTGF基因能显著减轻大鼠实验性肝纤维化，减少活化HSC数量可能是其改善肝纤维化的主要机制之一。

【关键词】  肝硬化； 肝星状细胞； RNA干扰； 结缔组织生长因子   

Effect of scilencing connective tissue growth factor on the liver fibrosis in rats    LI Guang-ming, LI Ding-guo, FAN Jian-gao, XIE Qing. Department of Gastroenterology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, China

Email: ligm68@ 126.com

【Abstract】 Objective    To investigate the anti-fibrogenesis property of intraportal vein small interfering RNA(siRNA) injection targeting connective tissue growth factor (CTGF) in a rat model of liver fibrosis induced by carbon tetrachloride (CCl4) and its effect on hepatic stellate cell (HSC) activation. Methods    24 male rats were randomly divided into four group. rats received CCl4 by subcutaneous injections every three days for 6 consecutive weeks, and meantime they also obtained either siRNA targeting CTGF (as CTGF siRNA group), saline (as model group) or a control siRNA (as control siRNA group) by intraportal vein injection to rats liver at the same approach. Other rats received saline intraportal vein injection for 6 weeks (as normal control group). The expressions of CTGF and α-SMA protein were detected by Western blot. Hepatic histology was evaluated by HE staining and Sirius red staining. The collagen staining areas were measured quantitatively using a computer-aided manipulator with slight modifications. The number of active HSC were evaluated by immunohistochemisty. Results    Six weeks after CCl4 injection, prominent upregulations were observed in the expressions of CTGF and α-SMA protein in saline or control siRNA-treated rats livers. In rats with CTGF siRNA treatment, the protein expressions of CTGF and α-SMA in liver decreased by 95%±2% and 86%±11% (F = 21.234 and 12.473, P < 0.01) respectively, the number of active HSC in liver decreased by 76%±9% (F = 9.179, P < 0.01) as compared to the model group. The attenuation of liver fibrosis was also observed in rats with CTGF siRNA treatment. Conclusion    Intraportal vein siRNA injection targeting CTGF could significantly inhibit CTGF gene expression in rats, thereby attenuate liver fibrosis by decreasing the number of active HSCs.

【Key words】Liver cirrhosis; Hepatic stellate cell; RNA interference; Connective tissue growth factor

肝星状细胞（HSC）活化是肝纤维化形成的中心环节。各种促肝纤维化细胞因子主要通过调控HSC参与肝纤维化的发生和发展过程[1]。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）是一种非结构性基质蛋白，能直接介导HSC的活化、合成及分泌细胞外基质（ECM）[2-3]。小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）是一种基因沉默的强大工具[4]。体外研究结果表明，siRNA沉默CTGF基因可显著抑制原代HSC的自发培养激活[5]。本研究对CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠经门静脉注射CTGF siRNA，观察其在体内的抗肝纤维化作用及其对HSC激活的影响。  

材料与方法

1.实验材料：SD大鼠购自中国科学院上海实验动物中心。CTGF 483 siRNA（序列483-503：正义链：5′-CCGCAAGAUUGGCGUGUGCTT-3′，反义链：5′-GCACACGCCAAUCUUGCGGTT-3′）、对照siRNA（为一随机序列，与CTGF无同源性，正义链：5′-GAAUGUUUUAAAUGGAGAUTT-3′，反义链：5′-AUCUCCAUUUAAAACAUUCTT-3′）均购自中国科学院上海生命研究院生物化学与细胞研究所；Oligofectamine及Opti-MEM1购自美国Invitrogen公司。小鼠β-肌动蛋白（actin）单克隆抗体购自美国Sigma公司，CTGF兔多克隆抗体购自英国Abcam公司，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体购自丹麦Dako公司，辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG及抗兔IgG第二抗体购自美国Amersham Biosciences公司。

2. 经门静脉皮下置管—肝靶向性给药通路的建立：雄性SD大鼠体质量（350±20）g，以戊巴比妥麻醉，腹中线切开，显露肠系膜上静脉，24号穿刺导管针从肠系膜上静脉分支插入。固定后，以硬膜外导管续接引入皮下，外接肝素帽后固定。供siRNA注射用。

3. 大鼠肝纤维化模型的诱导和siRNA干预[4]：经门静脉皮下置管术后4d，24只SD大鼠被随机分成4组。模型组：皮下注射40% CCl4（3ml/kg）及经门静脉注射等渗盐水300μl，每3d 1次，连续6周，CCl4首剂加倍；CTGF siRNA干预组：皮下注射CCl4及经门静脉注射CTGF siRNA（0.1mg/kg），每3天1次，连续6周；对照siRNA干预组：经门静脉注射对照siRNA，其余同上；正常对照组：经门静脉注射等渗盐水，量、频率与时间同上。CTGF siRNA干预组及对照siRNA组中，双链siRNA溶入Opti-MEM1，终体积300μl，经门静脉注射入大鼠肝脏；模型组及正常对照组则经门静脉注射等量等渗盐水；各组随后再注射入含0.1%肝素的等渗盐水100μl。在最后一次siRNA或等渗盐水注射后3d，取大鼠肝组织及外周血进行检测。

4. 肝组织学及免疫组织化学检测：以4%多聚甲醛固定矢状肝组织切片，石蜡包埋。制备2μm厚肝组织切片用于HE染色和Sirius red胶原染色。胶原染色面积以偏光扫描显微镜评估，结果以胶原染色面积百分比表示。免疫组织化学分析α-SMA表达情况：组织切片脱腊，磷酸盐缓冲液冲洗，以含3% H2O2甲醇溶液处理10min；切片与小鼠α-SMA单克隆抗体孵育1h；加生物素标记第二抗体孵育；用SLAB显色试剂显色。α-SMA染色阳性细胞由两位资深病理科医师随机选择5个视野进行计数，结果以每视野平均阳性细胞数表达。以METAVIR评分系统作为肝纤维化分级的标准[6]。

5. Western blot分析：取肝组织，以蛋白裂解液［含50mmol/L Tris-HCl (pH7.5)、150mmol/L NaCl、1% Triton X-100、10mg/ml脱氧胆酸钠、1mg/ml十二烷基硫酸钠、2mmol/L EGTA、1mmol/L苯甲基磺酰氟化物及蛋白酶抑制剂］匀浆裂解，用BCA蛋白质分析试剂盒测定蛋白质含量。取30μg蛋白，以10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离CTGF和β-actin蛋白质，转蛋白至硝酸纤维素膜；5%脱脂奶粉封闭2h；加第一抗体（CTGF兔多克隆抗体1∶3000稀释；β-actin小鼠单克隆抗体1∶3000稀释；α-SMA单克隆抗体1∶1000稀释）4℃孵育过夜；TBS-T（含0.2% Tween 20、20mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl，pH7.4）洗膜3次，每次15min；加第二抗体（辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG 1∶2000稀释；辣根过氧化物酶标记猴抗兔IgG 1∶2000稀释）37℃孵育1h，TBS-T洗膜3次，每次15min。用电化学发光（ECL）系统检测，胶片曝光，经显影、定影处理后观查结果。用Touching 2002凝胶成像系统对凝胶电泳进行扫描分析。

6. 统计学方法：资料以均数±标准差（x-±s）表示，用单侧单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. CTGF siRNA对实验大鼠肝组织CTGF蛋白表达的影响：Western blot结果经计算机灰度扫描并与内参照（β-actin）比较分析显示：CTGF蛋白在CTGF siRNA组较模型组显著减低，CTGF/β-actin蛋白灰度值比分别为0.0195±0.0012与0.7137±0.2637（F＝21.234，P<0.01）；正常对照组为0.0058±0.0014；对照siRNA组（0.6351±0.1078）与模型组相比，差异无统计学意义 (P＞0.05)。见图1。结果表明，经门静脉注射CTGF siRNA可显著抑制CCl4诱导的大鼠肝CTGF蛋白表达上调，而对照siRNA对CCl4诱导的大鼠肝CTGF蛋白表达上调无抑制作用。

2. CTGF siRNA沉默CTGF对实验大鼠肝纤维化的影响：HE染色结果显示：模型组大鼠肝组织呈广泛而严重的肝细胞脂肪变性、坏死，门静脉及中央静脉周围炎症细胞浸润和大量纤维结缔组织增生；与模型组相比，CTGF siRNA治疗组大鼠肝细胞变性、坏死、炎症细胞浸润及纤维结缔组织增生明显减轻（图2）。Sirius red染色结果显示：模型组大鼠肝组织胶原等纤维结缔组织广泛沉积，并相互交连呈网状，伴小叶结构紊乱，但无明显假小叶形成和肝硬化改变（图2）。胶原染色面积经偏光显微镜扫描显示：与模型组（11.8%±0.7%）相比，CTGF siRNA组（6.1%±0.3%）大鼠肝组织胶原染色面积明显减少（F＝57.248，P<0.01），对照siRNA组（12.1%±0.7%）大鼠肝组织胶原染色面积变化不明显（P＞0.05）。研究结果表明，siRNA沉默肝CTGF基因对CCl4诱导的大鼠肝纤维化具有显著的阻抑作用（表1）。

表1  实验大鼠肝纤维化病理学分级(只)

组别       样本数    0     Ⅰ    Ⅱ    Ⅲ    Ⅳ

正常对照组    6     6     0     0     0     0

CTGF siRNA组     6     0     4     2     0     0

对照siRNA组       6     0     0     0     5     1

模型组    6     0     0     1     4     1

  注：CTGF：结缔组织生长因子；siRNA：小干扰RNA

3. CTGF siRNA沉默CTGF对实验大鼠HSC激活的影响：（1）siRNA沉默CTGF对实验大鼠肝组织α-SMA基因表达的影响：HSC激活的分子标志是α-SMA基因表达显著上调。检测肝组织α-SMA蛋白表达是从分子水平判定HSC活化的一种有效方法，Western blot结果经计算机灰度扫描并与内参照（β-actin）比较分析显示：α-SMA蛋白表达水平在CTGF siRNA组（0.060±0.011）较模型组（0.440±0.051）明显减低（F＝12.473，P<0.01）；正常对照组为0.060±0.033；对照siRNA组（0.430±0.047）与模型组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。研究结果从分子水平证实：siRNA沉默CTGF能显著抑制CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织HSC激活。（2）siRNA沉默CTGF对实验大鼠肝组织HSC激活的影响：免疫组织化学染色显示：α-SMA染色阳性细胞数在CTGF siRNA组较模型组明显减少，分别为（5±3）个与（21±7）个，F＝9.179，P<0.01；空白对照组为0；对照siRNA组［（18±5）个］与模型组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。研究结果从细胞水平证实：siRNA沉默肝CTGF可显著抑制CCl4诱导的大鼠HSC激活，明显减少CCl4诱导的实验大鼠肝组织中活化HSC的数量。

讨    论

肝纤维化是肝脏对各种慢性损伤刺激的一种修复反应，主要与HSC及各种促纤维化细胞因子密切相关[1]。文献报道，在慢性肝病患者及实验性肝纤维化大鼠中，肝组织CTGF基因表达水平均明显增高并与肝纤维化病理学分级呈正相关，提示CTGF可能在肝纤维化发生和发展中起重要作用[2-3]。Western blot结果显示，经门静脉注射CTGF siRNA能特异地抑制CCl4介导的大鼠肝CTGF蛋白表达上调，而注射对照siRNA不能抑制肝CTGF蛋白表达上调。

肝组织HE染色和Sirius red染色是评价肝纤维化的主要检测手段，通过偏光扫描技术还可对肝组织胶原染色面积进行定量。HE染色和Sirius red染色结合胶原染色面积定量检测结果显示：与模型组相比，CTGF siRNA组大鼠肝细胞变性、坏死和肝组织胶原染色面积、肝纤维化程度明显减轻。结果表明：肝纤维化程度的减轻主要是源于肝组织CTGF基因表达的下调，因为注射对照siRNA的大鼠肝细胞损伤和肝组织胶原染色面积并无明显改变。

我们前期的研究结果证实siRNA沉默CTGF基因表达可抑制原代大鼠HSC的自发培养激活[5]。α-SMA是活化HSC的一种特征性标志，Western blot及免疫细胞化学染色结果显示：与模型组大鼠相比，CTGF siRNA组大鼠伴随CTGF下调，肝组织α-SMA蛋白表达水平显著下调，肝组织活化HSC数量亦显著减少。活化HSC减少是源于siRNA对大鼠肝组织CTGF基因的沉默作用，因为对照siRNA组大鼠肝组织α-SMA蛋白表达水平及活化HSC数量并无明显改变。

确认肝内活化HSC的异质性是近年来肝纤维化分子机制研究的一大重要进展[1]。除来源于静止HSC外，肝纤维化时肝内活化HSC还可来源于骨髓源性细胞、门静脉成纤维细胞、胆管内皮细胞及肝细胞上皮间充质转分化[7-8]。沉默CTGF减少HSC数量的机制，推测除与阻抑HSC激活外，可能也与抑制肝细胞上皮间充质转分化有关，具体机制仍有待进一步研究。

参  考  文  献

[1]Friedman SL. Mechanisms of hepatic fibrogenesis. Gastroenterology. 2008, 134: 1655-1669.

[2]Gressner OA, Gressner AM. Connective tissue growth factor: a fibrogenic master switch in fibrotic liver diseases. Liver Int, 2008, 28: 1065-1079.

[3]Gressner OA, Weiskirchen R, Gressner AM. Evolving concepts of liver fibrogenesis provide new diagnostic and therapeutic options.Comp Hepatol, 2007, 6: 7.

[4]Song E, Lee SK, Wang J, et al. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nat Med, 2003, 9: 347-351.

[5]Li G, Li D, Xie Q, et al. RNA interfering connective tissue growth factor prevents rat hepatic stellate cell activation and extracellular matrix production. J Gene Med, 2008, 10: 1039-1047.

[6]Poynard T, Bedossa P, Opolon P. Natural history of liver fibrosis progression in patients with chronic hepatitis C. The OBSVIRC, METAVIR, CLINIVIR, and DOSVIRC groups. Lancet. 1997,349:825-832.

[7]Choi SS, Diehl AM. Epithelial-to-mesenchymal transitions in the liver. Hepatology, 2009, 50: 2007-2013.

[8]Tong Z, Chen R, Alt DS, et al. Susceptibility to liver fibrosis in mice expressing a connective tissue growth factor transgene in hepatocytes.Hepatology, 2009, 50: 939-947.

（收稿日期：2010-01-10）

（本文编辑：朱红梅）

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