乙醇抑制大鼠骨髓间充质干细胞参与的肝细胞更新

 [关键词] 间质干细胞；肝细胞；乙醇；诱导分化

Ethanol inhibitor rat bone marrow mesenchymal stem cell differentiate into hepatocytes which take part in liver regeneration.

LIU Ying-li, LIU Wen-tian, HAN Ming-zhe, WANG Mei, SUN Chao-xia

[Key words] Mesenchymal stem cells; Hepatocyte; Ethanol; Differentiation induction

[First author's address] Department of Gastroenterology, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300052, China

Corresponding author: LIU Wen-tian, E-Mail:lwentian@sohu.com

乙醇是导致酒精性肝病的直接病因，肝脏更新的细胞来源有骨髓源性肝干细胞、造血干细胞、间质干细胞（MSCs）^［1-2］。MSCs由于其获取容易、很强的体外扩增能力、多向分化潜能和免疫调节能力，日益成为研究的焦点^［3］。长期大量摄入乙醇可以导致人体内多种代谢变化，体内微环境中乙醇及其代谢产物含量增加，本研究拟以体外试验探讨乙醇对MSCs参与的肝细胞更新的影响。

一 材料与方法

1. 主要材料：无特定病原级、4~6周龄、100~120g SD大鼠购自天津医科大学动物实验中心，基础培养基为90%低糖DMEN培养基，含质量体积分数为10%的胎牛血清和100mg/L青、链霉素，均购自美国Gibco公司，肝细胞生长因子（HGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）均购自美国peprotech公司，白蛋白（Alb）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒购自美国R&D公司。

2. 骨髓MSCs的分离与培养^［4］：采用冲骨髓法收集大鼠胫骨和腓骨的骨髓内细胞，离心、重悬、接种后，5%CO²，37℃环境下培养，每3天全量换液，细胞90%融合时进行传代。

3. 乙醇干预诱导分化最佳浓度筛选：生长良好的P3代随机分为5组：1~4组中乙醇的浓度分别为0.09、0.10、0.11、0.12mol/L，组5为对照组。连续计数8d绘制各组细胞生长曲线，筛选出乙醇干预诱导分化的最佳浓度。

4. 诱导分化：取生长旺盛的P4代以5×10⁵个/cm²密度接种，实验组随机分为2组，Ⅰ组培养基中细胞因子浓度参照文献［5-6］，为20ng/L HGF, 10ng/L bFGF，10ng/L EGF；Ⅱ组的培养液较Ⅰ组多含有乙醇，浓度为3中筛选出的最佳浓度。对照组的培养液基为基础培养基。

5. 细胞爬片糖原染色：分别对各组第3、6、9、12、15、18、21、24、27天留取的细胞爬片按照糖原染色试剂盒说明书进行糖原染色后镜检。

6. RT-PCR检测Alb和CK18的表达水平：分别各组第0、7、14、21天的细胞用Trizol提取RNA，引物序列参照文献［6］，PCR反应条件：Alb：94℃ 1min，58℃ 1min，72℃1min，35个循环； CK18：94℃ 1 min，60℃ 1min，72℃ 1min，35个循环；β-肌动蛋白：94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 45s，25 个循环。结束后取3μl产物电泳。

7. 细胞上清液中Alb水平检测：取培养第3、6、9、12、15、18、21、24、27天细胞的上清液经milipore超滤离心管浓缩后用Alb ELISA试剂盒进行检测。

8. 统计学方法：使用SPSS17.0采用方差分析或非参数检验方法分析数据，P <0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1. MSCs形态：原代接种后12h可见圆形细胞贴壁，1~2d后可见散在单个长梭形细胞后逐渐出现集落。至P₃代细胞形态基本一致为长梭形。

2. 乙醇干预诱导分化的最佳浓度：随着乙醇浓度的增加，MSCs形态上老化，增殖能力减弱，细胞内颗粒增多，细胞形态由长梭形变为扁平宽大，细胞内透亮脂质沉积增多。各组数量差异未见统计学意义，采用浓度较低的0.09mol/L作为观察乙醇对MSCs向肝细胞分化影响的浓度，以减少细胞数量差异对试验结果造成影响。

3. 诱导分化：Ⅰ组诱导后3d，约35%细胞由长梭形变为星芒状和多角形，局部50%以上细胞形态发生改变（图1A），约7d，细胞变圆，多角形的“触角”明显退缩并遗留细长条索（图1B）。第14天，绝大部分细胞变为类圆形，颗粒丰富，少数细胞内见小的空泡结构，后细胞形态变化较缓慢，至第28天，细胞呈较均一的类圆形，单层紧密排列(图1C)。Ⅱ组诱导3d，细胞形态改变与Ⅰ组相似，但体积略小并伴有宽大畸形细胞。第7天，个别宽大畸形的细胞内首次出现大空泡结构，于第14天，空泡样细胞增多，细胞内空泡数量和体积增大，至诱导后第28天，见大片区域性空泡样细胞集中分布（图1D），约占全部细胞数量的50%，其余细胞为较均一的类圆形。两组诱导过程中均有部分细胞成片脱落。对照组细胞形态始终为长梭形无变化，无细胞成片脱落。各组随机选取是10个高倍视野计空泡变性细胞个数，Ⅰ组为3.200±2.044，Ⅱ组为11.300±4.084，对照组为1.100±1.450，三组间差异有统计学意义（ t=20.961，P=0.000）。

（图1略，见印刷版）

A：Ⅰ组第3天，细胞由长梭形转变为多角形；B：Ⅰ组第7天，细胞呈现变圆趋势，原先多角形的触角部分明显退缩成纤细的条索；C：Ⅰ组第28天，细胞呈均一类圆形的形态，细胞排列紧密，颗粒明显；D：Ⅱ组d28，细胞呈现区域性空泡样变性集中分布

图1 间质干细胞经乙醇诱导后的形态变化  ×40

4. 糖原染色：Ⅰ组第14天可见糖原染色后呈淡粉红色的细胞，后淡粉染结构逐渐变多，颜色变深，于第28天阳性细胞染色最强。空泡样细胞经过糖原染色后，边缘呈现淡粉红色，证实其为脂脂肪细胞。Ⅱ组和对照组均未见糖原染色阳性细胞。

5. RT-PCR：Ⅰ组第7天即可见Alb mRNA，第14天表达最强，后逐渐较少并持续至第28天。Ⅱ组Alb表达较Ⅰ组表达减低。两组均可见CK18的低水平表达，对照组各基因表达均为阴性（图2）。

（图2略，见印刷版）

注：1～4：Ⅰ组第0、7、14、28天；5：相对分子质量标准；6～10：Ⅱ组第0、7、14、28天

图2 诱导后间质干细胞白蛋白mRNA表达的RT-PCR产物电泳图

6. 细胞上清液中Alb水平：取诱导后第3、6、9、12、15、18、21天时间点上，Alb表达量（ng/ml）分别为Ⅰ组：0.579±0.003、0.684±0.015、0.975±0.003、1.838±0.012、2.079±0.021、2.493±0.009、1.838±0.014、1.217±0.007、0.828±0.010；Ⅱ组0.428±0.005、0.441±0.027、0.655±0.011、0.888±0.019、1.038±0.005、1.138±0.013、1.055±0.027、0.766±0.010、0.383±0.021。两组浓度均呈现先上升后下降趋势，峰浓度出现在第18天，Ⅱ组变化趋势与Ⅰ组一致，但含量较Ⅰ组明显降低，差异有统计学意义（t=2.35，P=0.038，）。

三、讨论

在酒精性肝病的疾病发生和发展过程中，摄入的乙醇以及其代谢产物乙醛，对MSCs均具有代谢毒性，主要表现在抑制MSCs的增殖和分化能力上。李红等^［7］报道当乙醇浓度为0.1mol/L可以抑制MSCs增殖，乙醛浓度为4.5mmol／L时可抑制MSCs增殖，另外乙醇还抑制MSCs的成骨分化^［8］。形态学上，乙醇可使MSCs由长梭形转变为宽大畸形的细胞。

在联合应用多种细胞因子诱导MSCs向肝细胞分化的过程中，MSCs由原先的长梭形，逐渐转变为单层紧密排列的类圆形细胞，并且能表达Alb和CK18，分泌Alb和合成并储备糖原的功能，实现了向肝细胞的定向分化，仅个别散在细胞启动成脂分化。在乙醇存在的环境下，MSCs虽然也可以表达一定量的Alb和CK18，但其水平较无乙醇组明显减低，细胞不能合成糖原的，并约50%的细胞成脂分化，故可以得出，乙醇抑制MSCs的向肝细胞定向分化的功能，促进其成脂分化。若以上过程存在于体内环境下，则可能形成和进一步加重酒精性肝病患者的肝脏损害，形成恶性循环。同时，这也可能解释了酒精性肝病患者停止饮酒后，其肝功能在一定程度恢复的原因。另外，MSCs的成脂分化呈现区域性特性，考虑为细胞间可能存在局部分泌的信号物质，这可能解释了临床上部分患者表现为不均型脂肪肝的形成原因。

诱导第21天，部分细胞成片脱落，将细胞收集后进行锥虫蓝细胞活力染色证实细胞为存活细胞。成片脱落考虑与MSCs诱导后的肝细胞的贴壁能力下降有关。

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（收稿日期：2011-06-12）

（本文编辑：金生）

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