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乙醇抑制大鼠骨髓间充质干细胞参与的肝细胞更新

作者:刘应莉 刘文天 韩明哲 王玫 来源: 日期:2013/4/7 20:42:47 人气: 标签:
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 [关键词] 间质干细胞;肝细胞;乙醇;诱导分化

Ethanol inhibitor rat bone marrow mesenchymal stem cell differentiate into hepatocytes which take part in liver regeneration.

LIU Ying-li, LIU Wen-tian, HAN Ming-zhe, WANG Mei, SUN Chao-xia

[Key words] Mesenchymal stem cells; Hepatocyte; Ethanol; Differentiation induction

[First author's address] Department of Gastroenterology, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300052, China

Corresponding author: LIU Wen-tian, E-Mail:lwentian@sohu.com

 

乙醇是导致酒精性肝病的直接病因,肝脏更新的细胞来源有骨髓源性肝干细胞、造血干细胞、间质干细胞(MSCs)1-2。MSCs由于其获取容易、很强的体外扩增能力、多向分化潜能和免疫调节能力,日益成为研究的焦点3。长期大量摄入乙醇可以导致人体内多种代谢变化,体内微环境中乙醇及其代谢产物含量增加,本研究拟以体外试验探讨乙醇对MSCs参与的肝细胞更新的影响。

一 材料与方法

1. 主要材料:无特定病原级、4~6周龄、100~120g SD大鼠购自天津医科大学动物实验中心,基础培养基为90%低糖DMEN培养基,含质量体积分数为10%的胎牛血清和100mg/L青、链霉素,均购自美国Gibco公司,肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)均购自美国peprotech公司,白蛋白(Alb)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自美国R&D公司。

2. 骨髓MSCs的分离与培养4:采用冲骨髓法收集大鼠胫骨和腓骨的骨髓内细胞,离心、重悬、接种后,5%CO2,37℃环境下培养,每3天全量换液,细胞90%融合时进行传代。

3. 乙醇干预诱导分化最佳浓度筛选:生长良好的P3代随机分为5组:1~4组中乙醇的浓度分别为0.09、0.10、0.11、0.12mol/L,组5为对照组。连续计数8d绘制各组细胞生长曲线,筛选出乙醇干预诱导分化的最佳浓度。

4. 诱导分化:取生长旺盛的P4代以5×105个/cm2密度接种,实验组随机分为2组,Ⅰ组培养基中细胞因子浓度参照文献[5-6],为20ng/L HGF, 10ng/L bFGF,10ng/L EGF;Ⅱ组的培养液较Ⅰ组多含有乙醇,浓度为3中筛选出的最佳浓度。对照组的培养液基为基础培养基。

5. 细胞爬片糖原染色:分别对各组第3、6、9、12、15、18、21、24、27天留取的细胞爬片按照糖原染色试剂盒说明书进行糖原染色后镜检。

6. RT-PCR检测Alb和CK18的表达水平:分别各组第0、7、14、21天的细胞用Trizol提取RNA,引物序列参照文献[6],PCR反应条件:Alb:94℃ 1min,58℃ 1min,72℃1min,35个循环; CK18:94℃ 1 min,60℃ 1min,72℃ 1min,35个循环;β-肌动蛋白:94℃ 30s,55℃ 45s,72℃ 45s,25 个循环。结束后取3μl产物电泳。

7. 细胞上清液中Alb水平检测:取培养第3、6、9、12、15、18、21、24、27天细胞的上清液经milipore超滤离心管浓缩后用Alb ELISA试剂盒进行检测。

8. 统计学方法:使用SPSS17.0采用方差分析或非参数检验方法分析数据,P <0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1. MSCs形态:原代接种后12h可见圆形细胞贴壁,1~2d后可见散在单个长梭形细胞后逐渐出现集落。至P3代细胞形态基本一致为长梭形。

2. 乙醇干预诱导分化的最佳浓度:随着乙醇浓度的增加,MSCs形态上老化,增殖能力减弱,细胞内颗粒增多,细胞形态由长梭形变为扁平宽大,细胞内透亮脂质沉积增多。各组数量差异未见统计学意义,采用浓度较低的0.09mol/L作为观察乙醇对MSCs向肝细胞分化影响的浓度,以减少细胞数量差异对试验结果造成影响。

3. 诱导分化:Ⅰ组诱导后3d,约35%细胞由长梭形变为星芒状和多角形,局部50%以上细胞形态发生改变(图1A),约7d,细胞变圆,多角形的“触角”明显退缩并遗留细长条索(图1B)。第14天,绝大部分细胞变为类圆形,颗粒丰富,少数细胞内见小的空泡结构,后细胞形态变化较缓慢,至第28天,细胞呈较均一的类圆形,单层紧密排列(图1C)。Ⅱ组诱导3d,细胞形态改变与Ⅰ组相似,但体积略小并伴有宽大畸形细胞。第7天,个别宽大畸形的细胞内首次出现大空泡结构,于第14天,空泡样细胞增多,细胞内空泡数量和体积增大,至诱导后第28天,见大片区域性空泡样细胞集中分布(图1D),约占全部细胞数量的50%,其余细胞为较均一的类圆形。两组诱导过程中均有部分细胞成片脱落。对照组细胞形态始终为长梭形无变化,无细胞成片脱落。各组随机选取是10个高倍视野计空泡变性细胞个数,Ⅰ组为3.200±2.044,Ⅱ组为11.300±4.084,对照组为1.100±1.450,三组间差异有统计学意义( t=20.961,P=0.000)。

(图1略,见印刷版)

A:Ⅰ组第3天,细胞由长梭形转变为多角形;B:Ⅰ组第7天,细胞呈现变圆趋势,原先多角形的触角部分明显退缩成纤细的条索;C:Ⅰ组第28天,细胞呈均一类圆形的形态,细胞排列紧密,颗粒明显;D:Ⅱ组d28,细胞呈现区域性空泡样变性集中分布

图1 间质干细胞经乙醇诱导后的形态变化  ×40

4. 糖原染色:Ⅰ组第14天可见糖原染色后呈淡粉红色的细胞,后淡粉染结构逐渐变多,颜色变深,于第28天阳性细胞染色最强。空泡样细胞经过糖原染色后,边缘呈现淡粉红色,证实其为脂脂肪细胞。Ⅱ组和对照组均未见糖原染色阳性细胞。

5. RT-PCR:Ⅰ组第7天即可见Alb mRNA,第14天表达最强,后逐渐较少并持续至第28天。Ⅱ组Alb表达较Ⅰ组表达减低。两组均可见CK18的低水平表达,对照组各基因表达均为阴性(图2)。

(图2略,见印刷版)

注:1~4:Ⅰ组第0、7、14、28天;5:相对分子质量标准;6~10:Ⅱ组第0、7、14、28天

图2 诱导后间质干细胞白蛋白mRNA表达的RT-PCR产物电泳图

 

6. 细胞上清液中Alb水平:取诱导后第3、6、9、12、15、18、21天时间点上,Alb表达量(ng/ml)分别为Ⅰ组:0.579±0.003、0.684±0.015、0.975±0.003、1.838±0.012、2.079±0.021、2.493±0.009、1.838±0.014、1.217±0.007、0.828±0.010;Ⅱ组0.428±0.005、0.441±0.027、0.655±0.011、0.888±0.019、1.038±0.005、1.138±0.013、1.055±0.027、0.766±0.010、0.383±0.021。两组浓度均呈现先上升后下降趋势,峰浓度出现在第18天,Ⅱ组变化趋势与Ⅰ组一致,但含量较Ⅰ组明显降低,差异有统计学意义(t=2.35,P=0.038,)。

三、讨论

在酒精性肝病的疾病发生和发展过程中,摄入的乙醇以及其代谢产物乙醛,对MSCs均具有代谢毒性,主要表现在抑制MSCs的增殖和分化能力上。李红等7报道当乙醇浓度为0.1mol/L可以抑制MSCs增殖,乙醛浓度为4.5mmol/L时可抑制MSCs增殖,另外乙醇还抑制MSCs的成骨分化8。形态学上,乙醇可使MSCs由长梭形转变为宽大畸形的细胞。

在联合应用多种细胞因子诱导MSCs向肝细胞分化的过程中,MSCs由原先的长梭形,逐渐转变为单层紧密排列的类圆形细胞,并且能表达Alb和CK18,分泌Alb和合成并储备糖原的功能,实现了向肝细胞的定向分化,仅个别散在细胞启动成脂分化。在乙醇存在的环境下,MSCs虽然也可以表达一定量的Alb和CK18,但其水平较无乙醇组明显减低,细胞不能合成糖原的,并约50%的细胞成脂分化,故可以得出,乙醇抑制MSCs的向肝细胞定向分化的功能,促进其成脂分化。若以上过程存在于体内环境下,则可能形成和进一步加重酒精性肝病患者的肝脏损害,形成恶性循环。同时,这也可能解释了酒精性肝病患者停止饮酒后,其肝功能在一定程度恢复的原因。另外,MSCs的成脂分化呈现区域性特性,考虑为细胞间可能存在局部分泌的信号物质,这可能解释了临床上部分患者表现为不均型脂肪肝的形成原因。

诱导第21天,部分细胞成片脱落,将细胞收集后进行锥虫蓝细胞活力染色证实细胞为存活细胞。成片脱落考虑与MSCs诱导后的肝细胞的贴壁能力下降有关。

参考文献:

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(收稿日期:2011-06-12)

(本文编辑:金生)

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