甲胎蛋白调节肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体2表达及其对Bel7402细胞耐受该配体的影响

【摘要】  目的  研究甲胎蛋白（AFP）对肝癌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）受体-2（DR5）表达及其在肝癌细胞耐受TRAIL中的作用。 方法  用Western blot法分析全反式维甲酸（ATRA）处理人肝癌细胞株Bel 7402细胞24h后DR5表达的变化；免疫共沉淀（Co-IP）技术研究AFP与维甲酸受体（RAR）-β相互作用；激光共聚焦显微镜观察AFP与RAR-β的细胞共定位；RNA干扰技术抑制Bel 7402细胞AFP表达，再用ATRA处理24h后检测细胞内DR5表达的变化；用pcDNA3.1质粒和人AFP基因连接构建表达AFP的载体（称为pcDNA3.1-afp），然后转染到不表达AFP的人肝癌细胞株HLE细胞; 细胞生长状况用四甲基偶氮唑盐法检测。组间比较用t检验进行统计学分析。 结果  Bel 7402和HLE细胞低表达DR5，ATRA（160μmol/L）处理24h后能促进肝癌细胞DR5表达；Co-IP技术研究显示AFP能与RAR-β结合；共聚焦显微镜观察发现AFP与RAR-β共定位于细胞质；干扰AFP表达后，Bel 7402细胞的DR5表达明显提高，抑制AFP表达后，ATRA能显著促进Bel 7402细胞内DR5的表达，并增加Bel 7402细胞对TRAIL的敏感性；转染pcDNA3.1-afp载体后，HLE细胞内的AFP能与RAR-β结合，并发现pcDNA3.1-afp载体能对抗TRAIL诱导HLE细胞凋亡。 结论  Bel 7402细胞内表达的AFP具有抑制DR5表达的生物学功能；AFP可能通过抑制RAR-β入核调节DR5的表达；细胞内高表达的AFP是导致Bel 7402细胞耐受TRAIL诱导细胞凋亡的重要原因。

【关键词】  癌，肝细胞； 甲胎蛋白； TRAIL受体2； 细胞凋亡

Effects of alpha-fetoprotein on the expression of TRAIL death receptor-2 and its role on resisting the cytotoxicity of TRAIL in hepatoma cells   LIN You-shi*, ZHU Ming-yue, ZHOU Sheng, XIE Xie-ju, LI Meng-sen. *Department of Laboratory Medicine, Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, China

Corresponding author: LI Meng-sen, Email: mengsenli@163.com, Key Laboratory of Molecular Bioliogy, Hainan Medical University, Haikou 571101, China

【Abstract】    Objective    To explore the mechanism of Alpha-fetoprotein (AFP) effects on hepetocellular cancinoma cells (HCC) resistances apoptosis induced by tumor necrosis factor-related apoptosis inducing-ligand (TRAIL). Methods    The expressed alteration of TRAIL recepator-2 (DR5) after the human hepatoma cells line Bel 7402 (AFP-producing) and HLE cells (non-AFP producing) were treated with all trans retinoic acid (ATRA) were determined by Western blot; Interaction of AFP with RAR-beta was analyzed by co-immunoprecipitation (Co-IP); Laser confocal microscopy was used to observe co-localization of AFP and RAR-beta; Short small RNA interfering (RNAi) was applied to knock down the expression of AFP in Bel 7402 cells; The full AFP gene cDNA was inserted into pcDNA3.1 vector and constructed the expressed vector of AFP (named pcDNA3.1-afp); The growth of hepatoma cells was analyzed by MTT. Results    Bel 7402 and HLE cells expressed DR5, lowed dosage of ATRA (40μmol/L) had no influence on the expression of DR5 in Bel 7402 cells, but ATRA (160μmol/L) could inhibit the expression of AFP and promote the expression of DR5 significantly; Co-IP indicated that AFP had a property for interacting with RAR-beta; The results also demonstrated AFP co-localization with RAR-beta in cytoplasm of Bel 7202 cells; The expression of DR5 was enhanced while the expression of AFP was knocked down by RNAi. pcDNA3.1-afp vector was transfected into HLE cells, the growth of HLE cells were stimulated and TRAIL cytotoxicity of HLE cells were reduced. But when the expression of AFP was knocked down the sensitivity of Bel 7402 cells to TRAIL was enhanced. Conclusions    These data provided that AFP had a capability to interact with RAR-beta and suppressed the expression of DR5. AFP could play pivotal role on hepatoma cells resistance-induced apoptosis by TRAIL.

【Key words】      Carcinoma, hepatocellular;    Alpha-fetoprotein;    TRAIL receptor-2;    Apoptosis

甲胎蛋白（AFP）是肝癌细胞合成的特异性很高的蛋白质，被用作诊断肝癌的金标准，在临床上被认为是肝癌的经典肿瘤标记物。已经有大量研究证明肝癌细胞分泌的AFP具有促进肿瘤细胞增殖和抵抗淋巴细胞诱导癌细胞凋亡的双重作用[1]。有研究结果显示，AFP与癌细胞的恶性生长，转移和侵袭密切相关[2]。AFP高表达的肝癌患者预后效果让人沮丧[3]。并且有学者认为AFP是肿瘤耐药的关键性细胞因子[4]。这些研究结果提示，AFP具有潜在的抗凋亡诱导作用的生物学性质，然而，对肝癌细胞分泌的AFP在肝癌细胞耐受凋亡诱导过程中发挥怎样的作用，知之甚少。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing-ligand，TRAIL）是淋巴细胞分泌的、能特异性诱导肿瘤细胞凋亡的细胞因子[5-7]，其通过与死亡受体（DR5、DR4）结合启动凋亡信号[8]。肝癌细胞具有耐受TRAIL作用的特性[9]。然而，肝癌细胞通过何种机制逃避TRAIL的作用是一个有待阐明的科学问题。本研究旨在通过分析AFP在肝癌细胞内对TRAIL受体-2（DR5）表达的影响，探索AFP促进肝癌细胞逃避TRAIL诱导凋亡的一些分子机制。

材料与方法

一、 细胞系和蛋白质材料

人肝癌细胞株Bel 7402细胞和HLE细胞由北京大学医学部细胞生物学系提供；小鼠抗人AFP的单克隆抗体（编号：T-2），TRAIL受体-2（DR5，编号: 546），兔抗人维甲酸受体β（anti-RAR-β）多克隆抗体 (编号: 232) 购自美国Perfe Scientific公司；α-肌动蛋白（编号: sc-1616, 8432）单克隆抗体，Western blot发光试剂（编号: sc-2048）购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶连接的羊抗鼠、羊抗兔氨发光多克隆抗体；异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗兔（编号: 66288）和罗丹明（TRITC）标记的羊抗小鼠第二抗体（编号：61551）购自美国Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc；RNA干扰试剂盒pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector Kit（编号: E-07/F-07）购自上海吉玛制药技术有限公司（Shanghai GenePharma Co，Ltd）；All trans retinoic acid（ATRA，编号: 98F-0178）购自美国Sigma公司；pcDNA3.1载体购自广州泰盛生物技术有限公司。

二、实验方法

1. 细胞培养：用含有10%小牛血清的RPMI 1640培养基（均购自美国Gibco BRL公司）培养Bel 7402细胞，用DMEM培养液培养HLE细胞，待细胞长到80%融合时，用0.25%（质量体积分数）的胰蛋白酶消化细胞，再用含有10%小牛血清的RPMI 1640培养基吹散细胞，把细胞调整到一定的数目，进行以下的实验研究。

2. Western blot法分析相关基因的表达：Bel 7402细胞按1.0×105个/ml，培养于33cm2培养瓶中，每组设3个平行瓶，每瓶6ml，细胞被饥饿（用不含血清）的培养液培养24h后换成含10%小牛血清的培养液培养12h后，加入ATRA（40μmol/L、160μmol/L）处理24h，收集细胞，并裂解细胞，提取细胞蛋白质，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转膜，加入第一抗体在4℃轻轻混合12h，用辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠和羊抗兔第二抗体在室温轻摇动2h后，用发光显影法（Western blot luminol reagent，编号: sc-2048）检测细胞DR5蛋白的表达，并用日本FUJI公司LAS3000型化学发光/荧光（chmiluminescence/fluorescence）仪拍摄杂交蛋白质条带。

3. 激光共聚焦显微镜技术研究蛋白质的细胞内定位：20mm×20mm的盖玻片经过洁净处理，高温、高压消毒后放置于6孔细胞培养板中，然后加入用含有10%胎牛血清的RPMI 1640把细胞调整到2×104个/ml的细胞悬液2ml，待细胞长到70%融合，用4%多聚甲醛固定细胞30min，再用0.3%的曲拉酮-X 100浸泡细胞30min，去掉全部液体，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞3次，去掉全部液体，用体积分数为5%胎牛血清的PBS封闭细胞1h，去掉封闭液，加入小鼠抗人AFP的单克隆抗体（抗体浓度为1∶100）和兔抗人RAR-β的多克隆抗体（抗体浓度为1∶50），4℃轻摇12h，去掉第一抗体液体，用1ml PBS清洗细胞3次，加入FITC标记的羊抗兔第二抗体和TRITC标记的羊抗小鼠的第二抗体，室温轻摇2h（避光），再加入10μl浓度为100μg/ml的苯基吲哚（DAPI），室温轻摇30min（避光），去掉全部液体，用1ml PBS清洗细胞3次，用日本Olympus Fluoview FV1000型激光共聚焦显微镜观察标记结果并拍摄图像，选择荧光分子可能的重叠区域，分析荧光分子的共定位情况。

4. 免疫共沉淀技术分析AFP与RAR-β相互作用：Bel 7402细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640调整到2.0×104个/ml，5ml细胞悬液培养于33cm2的培养瓶，每组设2个平行瓶，细胞培养48h后，去掉培养液，换成含有10%血清的RPMI 1640再培养细胞24h，提取细胞蛋白质，蛋白质分4份，其中1份做Input，剩下的3份分别用抗AFP单克隆抗体、抗RAR-β的多克隆抗体和兔免疫血清（IgG）沉淀相应的抗原，然后用protein A agarose把抗原抗体复合物吸附于agarose珠子上，离心清洗其他蛋白质，再用上样缓冲液和高温变性方法使agarose珠子与蛋白质复合物分离，经过SDS-PAGE把抗原和抗体分离，再用Western blot分析相关的抗原，用LAS3000型化学发光/荧光仪拍摄杂交蛋白质条带。

5. RNA干扰AFP表达及其对DR5表达的影响:（1）20mm×20mm的盖玻片经过洁净处理，高温、高压消毒后放到6孔培养板中，加入用含有10%胎牛血清的RPMI 1640把Bel 7402细胞调整到2×104个/ml的细胞悬液2ml，待细胞长到80%融合，转染构建有siRNA-AFP序列的pGPU6/GFP/Neo质粒，干扰AFP表达的序列为：正义：5′-GAAC GTGGTCAATGTATAA-3′，反义：5′-TTAT ACATTGACCACGTTC-3′（称为AFP-siRNA）；阴性对照序列：正义: 5′-GTTCTCCGAACGTGT CACG-3′, 反义: 5′-ACGTGACACGTTCGGA GAA-3′(称为 control-siRNA)。用LipofectamineTM 2000（购自美国Invitrogen公司）促进转染，待转染12h后，去掉全部液体，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养细胞18h后，取出盖玻片，置于载玻片上，用荧光显微镜观察转染效率，并用Western blot分析AFP的表达，确定干扰效果。（2）Bel 7402细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640调整到2.0×104个/ml，5ml细胞液培养于33cm2的培养瓶，每组设2个平行瓶，待细胞80%融合后，转染已经构建有AFP-siRNA序列的pGPU6/GFP/Neo质粒，用LipofectamineTM 2000促进干扰载体转染细胞，转染12h后更换新的培养液再培养细胞18h，用ATRA（40μmol/L）处理细胞24h, 按Western blot分析方法提取细胞蛋白质并分析DR5表达。

6. AFP表达载体的构建及其对肝癌细胞DR5表达的影响：根据AFP的基因序列（GenBank登陆号：NM_001134）从人肝母细胞瘤HepG2细胞中扩增AFP基因的全长 cDNA（正义引物序列为5′-TA GGAATTCTAGCAACCATGAATGT GGTGG-3′,  反义为5′-AGCTCTAGATTAAACTCCCAAAG CAGCACG-3′）；PCR扩增条件为：95℃ 3min， 98℃ 10s，53℃ 10s，72℃ 2min，30个循环，72℃ 10min。 afp基因用EcoRⅠ和XbaⅠ进行酶切，置于pcDNA3.1质粒的CMV启动子之后，afp基因和载体pcDNA3.1连接后，命名为pcDNA3.1-afp载体，经酶切电泳和测序证明连接正确和基因结构完整。用LipofectamineTM 2000促进pcDNA3.1-afp载体转染HLE细胞36h后，Western blot分析HLE细胞的AFP和DR5表达情况。

7. 四甲基偶氮唑盐（MTT）分析AFP对肝癌细胞耐受TRAIL的影响：Bel 7402和HLE细胞按3×104个/ml培养于6孔板，每孔3ml,待细胞长到70%融合，用LipofectamineTM 2000促进AFP-siRNA或pcDNA3.1-afp载体分别转染Bel 7402或HLE细胞36h后，用0.25%胰酶消化，肝癌细胞按2.5×104个/ml培养于96孔培养板（0.33cm2）,对照组为自然培养的Bel 7402和HLE细胞。待细胞长到60%融合后，用2nmol/L和20nmol/L的TRAIL处理细胞24h后，加入终浓度为10μg/ml的MTT，继续培养4h，去掉全部液体，用PBS洗细胞3次，加入120ml二甲基亚砜，微震荡仪震荡30min, 用ELx-800UV Universal Microplate Reader（美国Bio-TEK Instrument公司）酶标仪测570nm波长的吸光度值（A值），代表细胞的生长状况。

8. 统计学分析：MTT分析的A值的组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结    果

1.  ATRA对Bel 7402细胞表达DR5表达的影响：Western blot 结果显示，Bel 7402细胞低表达DR5。小剂量的ATRA（40μmol/L）对Bel 7402细胞的DR5表达没有明显影响；用ATRA（160μmol/L）处理Bel 7402细胞后，能明显促进Bel 7402细胞表达DR5，作为溶质的二甲基亚砜（1.6%）也能轻微促进Bel 7402细胞表达DR5（图略）。

2. AFP-siRNA对Bel 7402细胞DR5表达的影响:Bel 7402细胞具有高表达AFP的特性，本研究采用AFP干扰片段和pGPU6/GFP/Neo质粒连接（AFP-siRNA）后转染Bel 7402细胞，通过AFP-siRNA抑制人肝癌Bel 7402细胞的AFP表达，结果显示，这个序列能有效干扰AFP表达，抑制AFP表达的效果达到75%以上（图略）；干扰人肝癌Bel 7402细胞AFP表达后，在自然培养条件下能轻微的促进癌细胞DR5的表达，但是用ATRA（40μmol/L）处理转染AFP-siRNA 30h后的癌细胞24h，DR5表达明显升高，说明Bel 7402细胞内高表达的AFP能抑制DR5的表达（图略）。

3. AFP与RAR-β在Bel 7402细胞内的共定位及它们相互结合状况：应用激光共聚焦显微镜观察发现，Bel 7402细胞内合成的AFP主要分布于细胞质，特别是在核周围有明显的聚集现象；而癌细胞内的RAR-β也主要集中在胞质，也有少量的RAR-β分布于细胞核内。在胞质的RAR-β较多聚集在细胞核周围；自然培养条件下，细胞内局部区域有AFP和RAR-β共定位现象（图略）；Co-immunoprecipitation （Co-IP）方法研究证明肝癌细胞内的AFP能与RAR-β结合，而且同时使用两种抗体沉淀抗原，均能检测到RAR-β-AFP复合体的存在，提示在自然培养的情况下，肝癌细胞内AFP与RAR-β能以复合体的形式存在（图略）。

4. AFP对肝癌细胞DR5表达的影响：把pcDNA3.1-afp导入HLE细胞36h后，Western blot结果显示，在HLE细胞里有AFP表达，转染pcDNA3.1-afp后能促进HLE细胞表达DR5（图略）。Co-IP结果显示，HLE细胞导入pcDNA3.1-afp后，AFP能与RAR-β结合，而非处理或导入空载体pcDNA3.1的HLE细胞，没有发现有RAR-β与AFP结合的现象，说明AFP具有与RAR-β结合特性（图略）。

5. AFP对肝癌细胞耐受TRAIL的影响：MTT检测结果显示，Bel 7402细胞耐受小剂量的TRAIL（2nmol/L）作用，但大剂量的TRAIL（20nmol/L）能显著抑制Bel 7402细胞生长；转染AFP-siRNA后，小剂量的TRAIL（2nmol/L）也能显著抑制Bel 7402细胞生长（图略）；而对于HLE细胞，大小剂量的TRAIL均能抑制 HLE细胞生长，但是导入pcDNA3.1-afp后，再用TRAIL（20nmol/L）处理，其抑制HLE细胞生长的作用消失，而导入空载体pcDNA3.1则没有pcDNA3.1-afp载体的对抗效果，提示pcDNA3.1-afp 在HLE细胞内表达的AFP具有对抗TRAIL的作用（图略）。

讨    论

肝癌细胞高表达AFP被认为与癌细胞的过度生长、转移和侵袭密切相关。有研究结果显示，抑制AFP的表达能诱导肝癌细胞凋亡，AFP也能与细胞内的信息物质结合，影响凋亡信号的传递[10]。这些研究结果提示，AFP的生物学功能具有多样性。有学者发现，AFP能与caspase-3结合而抑制caspase的级联反应[11]，显示AFP调节肝癌细胞信息传递具有中心轴的作用。

本研究结果显示，人肝癌细胞株Bel 7402细胞高表达AFP，也低表达DR5。肝癌细胞均能抵抗ATRA和TRAIL诱导细胞凋亡[12]。我们的研究结果显示，小剂量的ATRA对Bel 7402细胞的DR5表达没有明显影响，但是大剂量的ATRA能显著促进癌细胞表达DR5。尽管TRAIL有5种结合受体，但是由于DR5是TRAIL发挥其特异性诱导肿瘤细胞凋亡的关键性受体。当TRAIL与DR5结合后，通过caspase信号途径促进细胞凋亡；ATRA通过与其受体RAR-β等受体结合，改变这些胞内受体的空间结构，调节其转录功能，在这些受体中，RAR-β被认为是重要的抑癌蛋白，RAR-β具有转录调节作用，其进入细胞核内与靶基因结合抑制或促进基因的转录。本研究结果显示，ATRA能促进Bel 7402细胞DR5表达，提示ATRA与TRAIL的协同作用是由于ATRA能促进DR5表达，增加细胞膜表面的DR5的数量，这有利于TRAIL诱导肝癌细胞凋亡。Bel 7402细胞是高表达AFP的细胞系，但是AFP在肝癌细胞内如何抵抗TRAIL的作用一直是困惑科学界的问题。本研究结果显示，Bel 7402细胞内的AFP能抑制DR5的表达，干扰AFP表达后，小剂量的ATRA能促进肝癌细胞表达DR5，显示AFP具有对抗TRAIL的作用可能是通过抑制DR5表达导致的。

研究AFP对RAR-β的功能影响，能探索表达AFP的肝癌细胞耐受凋亡诱导的关键机制，也是认识AFP新功能的有力证据。本研究结果显示，人肝癌Bel 7402细胞在ATRA的作用下，不仅抑制AFP表达，而且也能促进DR5表达，显示DR5基因在肝癌细胞内可以被激活，可以推测DR5在肝癌细胞的沉默，不是基因突变或者基因结构改变导致的，而是基因表达的促进因子被抑制导致的。本实验用共聚焦显微镜观察结果提示，细胞内AFP和RAR-β有相互作用的可能。我们前期用荧光共振能量转移技术研究发现，AFP能与RAR-β相互作用，并阻止RAR-β迁移到细胞核，抑制RAR-β对survivin的转录调节作用，因而认为AFP是RAR-β的转录辅助因子[13]。也有研究结果显示，RAR-β进入细胞核能与DR5基因的启动子结合促进DR5的转录[14-15]。本研究结果显示，肝癌细胞内的AFP是一个抑制DR5表达的重要细胞因子。肝癌细胞内的AFP通过抑制RAR-β转录调节作用发挥其抗凋亡诱导的生物学功能。尽管临床上有30%～40%肝癌患者的血清AFP检测结果是阴性，但是并不是这些患者的肝癌细胞不表达AFP，而是由于癌细胞高表达AFP后不分泌到血清的缘故，所以绝大多数的肝癌细胞高表达AFP。AFP的表达对维持肝癌细胞在体内生长发挥重要的作用，分泌到血清的AFP不仅能促进肝癌细胞生长，而且也能抑制淋巴细胞的功能，促使肝癌细胞逃避免疫监视[15-16]；而胞内的AFP通过抑制凋亡信号的传递或激活生长信号导致肝癌细胞耐受肿瘤坏死因子家族诱导的细胞凋亡[17]。本研究结果提示，胞内的AFP具有抗凋亡诱导的生物学功能。AFP有3个功能明显不同的结构域，Sharapova等[18]推测AFP的结构域3具有能与胞内受体结合的特性，影响转录因子功能。本研究结果显示，AFP能与RAR-β结合，证实了Dauphinée提出的假说。RAR-β广泛表达于各种细胞，但是在肝癌细胞内，由于有AFP存在，AFP能与RAR-β结合并形成复合体，阻止RAR-β进入细胞核内，用ATRA处理肝癌细胞能抑制AFP表达，减少其对RAR-β功能的抑制作用，导致RAR-β促进DR5的表达，这就是肝癌细胞对ATRA和TRAIL联合作用敏感性增加的关键机制。本研究结果提示，胞质内AFP可通过抑制DR5的表达导致肝癌细胞对TRAIL的耐受，靶向干扰AFP表达可能是有效促进TRAIL诱导肝癌细胞凋亡的新策略。

参  考  文  献

[1]Behboudi S, Alisa A, Boswell S, et al. Expansion of anti-AFP Th1 and Tc1 responses in hepatocellular carcinoma occur in different stages of disease. Br J Cancer, 2010, 102: 748-753.

[2]Mitsuhashi N, Kobayashi S, Doki T, et al. Clinical significance of alpha-fetoprotein: involvement in proliferation, angiogenesis, and apoptosis of hepatocellular carcinoma. J Gastroenterol Hepatol, 2008, 23(7 Pt 2): e189-197.

[3]Miyaaki H, Nakashima O, Kurogi M, et al. Lens culinaris agglutinin-reactive alpha-fetoprotein and protein induced by vitamin K absence II are potential indicators of a poor prognosis: a histopathological study of surgically resected hepatocellular carcinoma. J Gastroenterol, 2007, 42: 962-968.

[4]Moskaleva EYu, Posypanova GA, Shmyrev II, et al. Alpha-fetoprotein-mediated targeting--a new strategy to overcome multidrug resistance of tumour cells in vitro. Cell Biol Int, 1997, 21: 793-799.

[5]Grisendi G, Bussolari R, Cafarelli L, et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res, 2010, 70: 3718-3729.

[6]Wang C, Qi R, Li N, et al. Notch1 signaling sensitizes tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells by inhibiting Akt/Hdm2-mediated p53 degradation and up-regulating p53-dependent DR5 expression. J Biol Chem, 2009, 284: 16183-16190.

[7]Mucha SR, Rizzani A, Gerbes AL, et al. JNK inhibition sensitises hepatocellular carcinoma cells but not normal hepatocytes to the TNF-related apoptosis-inducing ligand. Gut, 2009, 58: 688-698.

[8]Kim MO, Moon DO, Kang CH, et al. beta-Ionone enhances TRAIL-induced apoptosis in hepatocellular carcinoma cells through Sp1-dependent upregulation of DR5 and downregulation of NF-kappaB activity. Mol Cancer Ther, 2010, 9: 833-843.

[9]Lu G, Liu Y, Ji B, et al. Synergistic effect of celecoxib on TRAIL-induced apoptosis in hepatocellular carcinoma cells. Cancer Invest, 2010, 28: 629-634.

[10]Won YS, Lee SW. Targeted retardation of hepatocarcinoma cells by specific replacement of alpha-fetoprotein RNA. J Biotechnol, 2007, 129: 614-619.

[11]Li MS, Liu XH, Zhou S, et al. Inhibited the expression of alpha fetoprotein by all trans retinoic acid sensitize hepatoma cells to tumor necrosis factor-related apoptosis-induced ligand(TRAIL)[abstract]. Gastroenterology, 2007, 132: A822-A823.suppl 2.

[12]Chen KF, Yeh PY, Hsu C, et al. Bortezomib overcomes tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand resistance in hepatocellular carcinoma cells in part through the inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway. J Biol Chem, 2009, 284: 11121-11133.

[13]Li M, Li H, Li C, et al. Cytoplasmic alpha-fetoprotein functions as a co-repressor in RA-RAR signaling to promote the growth of human hepatoma Bel 7402 cells. Cancer Lett, 2009, 285: 190-199.

[14]Kouhara J, Yoshida T, Nakata S, et al. Fenretinide up-regulates DR5/TRAIL-R2 expression via the induction of the transcription factor CHOP and combined treatment with fenretinide and TRAIL induces synergistic apoptosis in colon cancer cell lines. Int J Oncol, 2007, 30: 679-687.

[15]Greten TF, Ormandy LA, Fikuart A, et al. Low-dose cyclophosphamide treatment impairs regulatory T cells and unmasks AFP-specific CD4+ T-cell responses in patients with advanced HCC. J Immunother, 2010, 33: 211-218.

[16]Ayaru L, Pereira SP, Alisa A, et al. Unmasking of alpha-fetoprotein-specific CD4(+) T cell responses in hepatocellular carcinoma patients undergoing embolization. J Immunol, 2007, 178: 1914-1922.

[17]Li M, Li H, Li C, et al. Alpha fetoprotein is a novel protein-binding partner for caspase-3 and blocks the apoptotic signaling pathway in human hepatoma cells. Int J Cancer, 2009, 124: 2845-2854.

[18]Sharapova OA, Pozdnykova NV, Laurinavichyute DK, et al. High-efficient expression, refolding and purification of functional recombinant C-terminal fragment of human alpha-fetoprotein. Protein Expr Purif, 2010, 73: 31-35.

(收稿日期：2010-04-29）

（本文编辑：金生）

中华医学会肝脏病杂志版权