缺血预处理对大鼠冷保存供肝线粒体胆固醇含量和细胞色素c释放的影响

【关键词】  缺血预处理； 线粒体； 胆固醇； 细胞色素c类

Effects of ischemic precondition on the content of cholesterol in mitochondria and cytochrome c expression in hepatocytes following cold preservation in rats    JU Wei-qiang, WU Zhi-peng, HE Xiao-shun, WU Lin-wei, TAI Qiang, WANG Dong-ping, ZHU Xiao-feng, HUANG Jie-fu.

【Key words】     Ischemic precondition;    Mitochondria;    Cholesterol;    Cytochromes c

【First author抯 address】   Organ Transplantation Center, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China

Corresponding author: HE Xiao-shun, Email: weiqiangju@163.com

肝脏移植中供肝的缺血再灌注损伤一直是影响肝脏移植效果的重要因素之一。如何尽可能地减轻供肝的缺血再灌注损伤一直是器官移植研究的热点及难点问题，其中缺血预处理（ischemic preconditioning, IP）的内在保护效应在不同种属的动物和不同器官均得到证实[1-4]。但缺血预处理的作用机制至今仍不十分清楚，其是否通过线粒体途径对抗细胞凋亡至今仍未明确。本实验旨在探讨缺血预处理能否对抗线粒体凋亡及其可能的机制。

一、材料与方法

1. 实验动物：Sprague-Dawley大鼠（无特定病原级，购自中山大学动物实验中心），雄性，体质量200～250g，作为冷保存供肝供体。术前大鼠禁食12h，但自由进水。

2. 药物配制：阿托伐他汀（atorvastatin）购自辉瑞制药公司，相对分子质量为1155.36。10.40mg和34.66mg阿托伐他汀分别加入300μl二甲基亚砜溶解，随后加入300ml UW液中，最终浓度为30μmol/L和100μmol/L，反向验证实验结果。

3. 实验分组：将25只大鼠随机分为对照组（C组）、冷保存组（I组）、缺血预处理组（IP组）、阿托伐他汀30μmol/L和100μmol/L处理组（A30组和A100组），每组5只，C组为正常大鼠肝脏（4℃ UW液灌注）；I组为灌注后冷保存8h；IP组先给予缺血预处理，灌注后冷保存8h；A30组和A100组先给予缺血预处理，用终浓度为30μmol/L和100μmol/L的阿托伐他汀UW液灌注后再放入含30μmol/L和100μmol/L的阿托伐他汀UW液中4℃冷保存8h。

4. 手术方式：按照大鼠肝移植模型建立中供肝切取的手术方式实施手术，缺血预处理方式是先阻断肝门部的肝动脉和门静脉10min，不阻断胆总管，随后复流10min，最后行腹腔动脉灌注。灌注时先给予20ml 4℃含肝素的乳酸林格氏液，再给予UW液或含有阿托伐他汀的UW液，灌注完毕后完整切下大鼠肝脏给予相应的处理。

5. 大鼠肝组织线粒体提取：取大鼠肝组织约150mg提取线粒体，同时保留上清液用于测定胞质细胞色素c（cytochrome c，Cyto c）。蛋白浓度测定采用Bradford法。

6. 大鼠肝组织线粒体胆固醇/磷脂测定：胆固醇测定采用酶法测定，磷脂测定采用无机磷测定法。

7. 大鼠肝组织线粒体和胞质Cyto c的Western blot测定：以40μg蛋白上样量进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，细胞质蛋白以β-肌动蛋白（抗体购自美国Sigma公司）作为内参照，线粒体蛋白以电压依赖性阴离子通道蛋白（VDAC）作为内参照（鼠抗人线粒体VDAC蛋白单克隆抗体购自美国Calbiochem公司）。

8. 统计学方法：连续性变量用均数±标准差（x-±s）表示，多组均数两两比较采用q检验（Newman-Keuls法），P＜0.05为差异具有统计学意义。

二、结果

1. 大鼠肝组织线粒体胆固醇含量的测定结果：C、I、IP、A30、A100组线粒体胆固醇含量分别为（27.98±2.21）nmol/mg、（16.43±1.94）nmol/mg、（32.54±2.40）nmol/mg、（18.77±1.72）nmol/mg、（13.21±1.15）nmol/mg，各组间差异均有统计学意义，P值均＜0.05。

2. 大鼠肝组织线粒体磷脂含量的测定结果：C、I、IP、A30、A100组线粒体磷脂质量分数分别为（10.34±0.43）×10-3、（9.68±0.37）×10-3、（11.05±0.42）×10-3、（10.12±0.38）×10-3、（9.57±0.41）×10-3，各组间差异均无统计学意义，P值均＞0.05。

3. 大鼠肝组织线粒体和胞质的Cyto c Western blot测定结果：C、I、IP、A30、A100组Cyto c相对表达量分别为1.25±0.50、0.48±0.11、1.12±0.24、0.67±0.18、0.38±0.10；细胞质Cyto c相对表达量分别为0.02±0.003、1.15±0.09、0.05±0.004、0.82±0.07、1.29±0.11；各组间差异均有统计学意义，P值均＜0.05，见图1。

三、讨论

本实验结果显示，大鼠供肝细胞线粒体胆固醇的变化与Cyto c的释放变化呈一致性：即线粒体胆固醇增加，则其Cyto c的释放减少，线粒体胆固醇减少，则其Cyto c的释放增加。上述现象在一些癌细胞中具有相似的表现[5-6]。提示缺血预处理增强细胞生存并避免凋亡的内源性机制之一就是促进线粒体胆固醇的升高。

目前，对于线粒体胆固醇升高对抗细胞凋亡的机制已有了初步的研究结果。主要集中在肿瘤细胞线粒体升高的胆固醇对抗凋亡的研究[7]。肿瘤细胞线粒体输出的柠檬酸要比正常细胞的线粒体高出4倍左右，这部分是由于三羧酸载体活性增加导致柠檬酸和异柠檬酸从线粒体内膜转出增加[8]。Wolf等[9]发现，线粒体升高的胆固醇可以明显抑制膜质子渗透性，也可以消除ATP/ADP载体帮助启动线粒体渗透转运能力。此外，升高的线粒体胆固醇还可抑制Bax形成线粒体渗透转运孔形成，从而抑制了凋亡的发生[10]。升高的胆固醇最主要的是可以控制线粒体膜的代谢转运活性，VDAC是线粒体膜上最重要的代谢转运通道，升高的线粒体可以明显影响VDAC的转运。尽管癌细胞升高的胆固醇部分是由于柠檬酸从线粒体到胞质增加转运所致，而VDAC可能参与已合成的胆固醇从胞质转运至线粒体[11]，因为胆固醇在胞质和内质网合成。VDAC 72位的谷氨酸是己糖激酶（hexokinase, HK）结合VDAC所必需，E72Q突变将会阻断HK结合到VDAC和线粒体，同时导致Morris肝癌细胞线粒体胆固醇的下降[12]。这些研究结果显示，HK结合到VDAC在某种程度上刺激了胆固醇被摄取到线粒体上，而升高的线粒体胆固醇也可促进HK和VDAC的结合。因此，当HK结合到线粒体将促进线粒体胆固醇摄取正反馈发生。升高的胆固醇则引起Bax与ANT的功能失调，同时抑制VDAC的开放，HK-Ⅰ可直接作用于VDAC，抑制其孔的开放，从而抑制Cyto c释放。HK-Ⅱ结合VDAC可以抑制细胞死亡的发生。这种升高的线粒体胆固醇增加了肿瘤细胞抵抗损伤能力，进一步可以抵抗凋亡甚至死亡的发生而长期存活。

对于缺血预处理升高线粒体胆固醇的机制，一方面，我们既往的研究结果提示3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶活性和合成明显增加，另一方面当细胞缺血缺氧后，HK的活性明显增加，其催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖进入糖酵解合成ATP过程，上述两方面的作用，导致了线粒体胆固醇的含量升高，同时通过糖酵解的加强保持了细胞ATP一定的含量，细胞从而避免了凋亡和死亡。

参  考  文  献

[1]Aberg AM, Ahlstr鰉 K, Abrahamsson P, et al. Ischaemic pre-conditioning means an increased adenosine metabolism with decreased glycolytic flow in ischaemic pig myocardium. Acta Anaesthesiol Scand, 2010, 54: 1257-1264.

[2]Gross GJ, Gauthier KM, Moore J, et al. Evidence for role of epoxyeicosatrienoic acids in mediating ischemic preconditioning and postconditioning in dog. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2009, 297: H47-52.

[3]Moore-Olufemi SD, Olufemi SE, Lott S, et al. Intestinal ischemic preconditioning after ischemia/reperfusion injury in rat intestine: profiling global gene expression patterns. Dig Dis Sci, 2010, 55: 1866-1877..

[4]Jin LM, Liu YX, Zhou L, et al. Ischemic preconditioning attenuates morphological and biochemical changes in hepatic ischemia/reperfusion in rats. Pathobiology, 2010, 77: 136-146.

[5]Makky A, Michel JP, Ballut S, et al. Effect of cholesterol and sugar on the penetration of glycodendrimeric phenylporphyrins into biomimetic models of retinoblastoma cells membranes. Langmuir, 2010, 26: 11145-11156.

[6]Wu J, Wei B. Effects of atorvastatin on non-alcoholic steatohepatitis and tumor necrosis factor-alpha in serum of hypercholesterolemia rabbits. Nanhua Daxue Xuebao(Yixueban), 2010, 38: 311-314.

吴洁,韦兵.阿托伐他汀对高胆固醇血症兔脂肪肝形成及血清肿瘤坏死因子-α的影响.南华大学学报(医学版),2010,38:311-314.

[7]Messerschmidt SK, Musyanovych A, Altvater M, et al. Targeted lipid-coated nanoparticles: delivery of tumor necrosis factor-functionalized particles to tumor cells. J Control Release, 2009, 137: 69-77.

[8]Campbell AM, Chan SH. Mitochondrial membrane cholesterol, the voltage dependent anion channel (VDAC), and the Warburg effect. J Bioenerg Biomembr, 2008, 40: 193-197.

[9]Wolf NM, Mueller K, Hirche F, et al. Study of molecular targets influencing homocysteine and cholesterol metabolism in growing rats by manipulation of dietary selenium and methionine concentrations. Br J Nutr, 2010, 104: 520-532.

[10]Lucken-Ardjomande S, Montessuit S, Martinou JC. Bax activation and stress-induced apoptosis delayed by the accumulation of cholesterol in mitochondrial membranes. Cell Death Differ, 2008, 15: 484-493.

[11]Herrera JL, Diaz M, Hern醤dez-Fernaud JR, et al. Voltage-dependent anion channel as a resident protein of lipid rafts: post-transductional regulation by estrogens and involvement in neuronal preservation against Alzheimer's disease. J Neurochem, 2011, 116: 820-827.

[12]Arzoine L, Zilberberg N, Ben-Romano R, et al. Voltage-dependent anion channel 1-based peptides interact with hexokinase to prevent its anti-apoptotic activity. J Biol Chem, 2009, 284: 3946-3955.

(收稿日期：2010-07-21）

（本文编辑：金生）

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