原发性肝癌基因治疗中动物模型的研究现状

【关键词】   癌，肝细胞；   基因疗法；   模型，动物 

Present study on animal models in gene therapy for primary hepatocellular carcinoma    WANG Ge, CHEN Chuan.

【Key words】    Carcinoma, hepatocellular; Gene therapy;   Models, animal

【First author's address】  Cancer Center, Institute of Surgical Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China

Email: wangge70@hotmail.com

原发性肝癌(PHC)是我国常见的恶性肿瘤，大部分中晚期患者伴有严重的肝功能不全或肝内及远处转移，现有治疗手段如系统性化疗、经肝动脉化疗栓塞、放射治疗等疗效均欠佳[1]；寻找新的、更有效的治疗方法是临床上亟待解决的问题。近年来，随着分子生物学理论和基因重组技术的不断发展，肝癌基因治疗取得了很大进展，已显示出广阔的应用前景[2]。

动物模型是肝癌基因治疗研究中重要的平台和手段，自20世纪初以来，先后出现了自发性肝癌模型、诱发性肝癌模型、移植性肝癌模型、转基因肝癌模型等[3]。理想的动物模型可以模拟人体肝癌发生、发展的病理过程，有助于广泛、深入地研究PHC不同亚型以及不同发展阶段的分子改变，确定肝癌特异性的预后标志物和治疗靶点，评估基因治疗方案的可行性、有效性、安全性，从而推动基因治疗的发展。

一、自发性肝癌动物模型 

自发性肝癌动物模型是指实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下发生肿瘤。其肝癌的发生、发展与人类肝癌相似，反映了动物的肿瘤易感性和环境致癌物质、促癌物质的积聚程度，但其发生率低且不稳定，发生时间较长、难预测且参差不齐，荷瘤动物个体在动物(性别、体质量、肿瘤发生时间等)和肿瘤(大小、数目、部位等)两方面差异较大，目前主要用于病理学研究和作为移植性肿瘤的瘤源，对筛选和分析肝癌相关基因价值不大[4]。

二、诱发性肝癌动物模型 

诱发性肝癌动物模型是指用化学、物理、生物等致癌因素在实验条件下诱发动物发生肝癌，是进行实验肿瘤学研究的重要工具。其中，化学性致癌物[二乙基亚硝胺、四氯化碳、四氯乙醇、二甲基亚硝胺(DEN)、硫代乙酰胺]诱导法最常用[3]；可以单用一种具有基因毒性的致癌物反复给药诱发肝癌，也可用致癌物与促癌物如phenobarbital(PB)或肝大部分切除术组合成的两步诱癌方案，在此过程中，少部分未发生凋亡的肿瘤起始细胞获得自发性生长的特性，进展为非典型增生结节并最终发展成肝癌。实验动物多选用敏感性高的纯系大鼠如Wistar、Spraque -Dawley和Fischer344。

DEN是应用最广泛的化学性致癌物，高剂量的DEN通过诱导氧化应激、DNA损伤等机制促进肝癌发生，可稳定可靠地诱发大鼠肝癌形成，且与大鼠的性别、年龄、种系有关，如sv129大鼠(20 mg/kg DEN) 30～55周肝癌的形成率为80%～100%，C57BL6/J大鼠(5 mg/kg DEN) 40～70周肝癌的形成率为84%，C3H/HE大鼠 (90 mg/kg DEN) 45～75周后肝癌的形成率为100%。在该模型中，从肝局灶结节样增生、肝硬化增生结节到肝细胞肝癌发展的诱癌过程往往伴随着基因组不稳定、基因突变、细胞信号通路调控异常等生物学特性改变，接近人类肝癌的发病特点，为观察肝癌的进展变化、研究癌相关基因的分子致病机制以及评估药物治疗的可行性、有效性、安全性等提供了一个易操控的系统[3]。多项研究结果显示，在PHC细胞株及动物模型中，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路成员如c-H-Ras、c-Ki-Ras、c-Raf、c-Fos和c-Jun的表达以及活性都是增加的。在单发肝癌以及化学诱发性小鼠肝癌中，还检测到细胞外调节蛋白激酶（ERK）上游的Ras基因发生了突变。这些分子改变在人肝癌标本中同样存在，并且是肝癌患者总生存期的独立预后标志物[5-6]。在此类模型中，法尼基转移酶抑制剂如洛伐他汀(lovastatin)对Ras相关肿瘤具有抑制作用的研究已进入临床前实验阶段[7]；MEK1/2抑制剂司美替尼(selumetinib，AZD6244)联合雷帕霉素(rapamycin)具有明显抗肿瘤生成及血管生成的效应[8]。

诱发性肝癌动物模型常用于肝癌病因学、发生学、发病机制、遗传及生物学方面的研究，但是由于存在诱导周期长(3～6个月)、成本高、成功率低，以及肝癌出现的时间、部位、病灶数等在个体之间表现不均一等问题，因此，研究人员应当根据目的及客观条件选择。

三、移植性肝癌动物模型

移植性肝癌动物模型是指将肝癌组织或细胞移植到动物体内(肝脏、肝外组织或器官)或非肝脏来源的恶性肿瘤如乳腺癌等移植到动物的肝脏所形成的肝癌动物模型。根据受体动物不同，移植性肝癌模型可分为正常动物移植性肝癌模型和免疫缺陷动物移植性肝癌模型。前者受体动物多为小鼠和大鼠，后者受体动物多为裸鼠。对于正常动物移植性肝癌模型，目前应用较多的为自发性肝外-肝同种移植性大鼠肝癌模型。常用的免疫缺陷动物移植性肝癌模型有人-裸小鼠异种移植肝癌模型、人-裸大鼠异种移植肝癌模型、人肝癌裸鼠皮下-肝原位移值瘤模型[9]。此外，兔VX2肝癌是迄今惟一能够在较大动物体内建立的肝转移性肿瘤模型，该模型简便易行、价格相对低廉，且实验周期短，目前多用于肝脏肿瘤的影像学和治疗学研究。

在PHC异种移植动物模型中，AZD6244具有显著抑制PHC生长的作用，并呈剂量依赖性；联合应用AZD6244可提高索拉非尼的抗肿瘤活性。但是，AZD6244单药应用无明显效果，表明仅仅抑制MAPK信号通路不足以提高PHC的临床疗效。目前AZD6244联合索拉非尼的研究已进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验[10]。用移植方法制作肝癌动物模型的周期一般较短，肿瘤来源为人类，生长的大小和位置较易控制，但肿瘤是生长在正常肝组织背景下，宿主缺乏免疫监视与免疫逃避机制，与人肝癌多发生在肝炎、肝硬化背景下有所不同，操作相对复杂。裸鼠人肝癌移植模型技术要求高，且饲养困难、价格昂贵。

四、转基因肝癌动物模型 

转基因肝癌动物模型是指借助基因工程手段将特定的外源基因导入动物的染色体内，使其发生整合、遗传繁殖，并由此培养出携带外源基因的转基因动物所形成的肝癌模型；主要用来研究特殊基因的功能和不同基因在肝癌发展过程中的相互作用，也可用于研究特殊基因与肝特异性致癌物之间的关系，为肝癌的基础理论和临床研究开辟了一个新的领域，具有广阔的前景[11]。导入基因的方法常有显微注射、逆转录病毒感染、胚胎干细胞植入等；转入动物体内的外源性基因可为单基因(如HBx、c -myc、SV40等)，也可为双基因[如c-myc/转化生长因子（TGF）α、c -myc/TGFβ1、HBx/c-myc等]。主要的转基因肝癌模型有HBV转基因肝癌模型、猴病毒40(sv40)转基因肝癌模型等[12]。HBV、HCV可整合进入宿主染色体，促进有丝分裂因子分泌、激活癌基因，导致肝细胞急、慢性损伤和炎症，是人类肝炎和肝癌发生的重要病因。肝炎病毒转基因动物模型为肝癌发病机制的研究提供了新的途径，但目前建立此类模型的技术尚不够成熟，如今用得最多的是HBsAg转基因小鼠模型、HBx转基因小鼠模型及HCV结构基因(包括核心蛋白和包膜蛋白E1、E2编码基因)的转基因小鼠动物模型。

应用TGFα和c -Myc/TGFα转基因肝癌动物模型，Calvisi等[13]证实抗NO合成的氨基胍腚(aminoguanidine)可通过调控IKK/NF-κB以及Ras/ERK信号通路而抑制PHC细胞增殖，促进其凋亡。而NF-κB信号通路被柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)或MEK抑制剂UO126阻断可导致PHC细胞中诱导型一氧化氮合酶下调[14]。此外，pAKT和p -mTOR过表达也是c-myc/TGF-α转基因小鼠肝癌中常见的分子事件，并与肿瘤分级、肝内转移以及血管侵袭有关，抑制其活性可有效提高小鼠存活率、预防复发[15]。目前，PI3K抑制剂RG7321以及AKT抑制剂哌立福新（perifosine）仍处于早期临床试验阶段，对mTOR抑制剂依维莫司（everolimus，RAD001）、西罗莫司(sirolimus，Rapamune)、特癌适(temsirolimus，CCI-779)的研究则更为广泛，也最具有临床应用前景[16]。其中，依维莫司与安慰剂的对比试验研究已经进入Ⅲ期临床试验，另一项依维莫司与索拉非尼的联合应用正处于Ⅱ期临床随机试验。

用转基因技术建立的肝癌动物模型可以很好地模拟肿瘤微环境等体内的生理、病理环境，且可模拟部分癌前病变，与肝癌的发生过程具有较好的一致性。但转基因肝癌动物模型制作技术要求极高、价格昂贵、诱癌时间长、小鼠的遗传背景可影响肿瘤发生的类型，因此，主要用于研究基因改变对肝癌形成的影响。目前，转基因肝癌动物模型的研究在国内开展得还比较少，但其对于研究特殊基因在肝癌形成过程中的作用和研究肝癌发展的多步骤过程非常有用，是肝癌动物模型未来发展的方向。

五、问题与展望

肝癌发生是一个多因素、多基因、多环节的过程，涉及不同染色体上多种基因的变化，并且基因改变呈现广泛的异质性，单一基因治疗显然是不全面的，这也是目前基因治疗对肝癌作用有限的主要因素，随着分子生物学技术的发展，建立低毒、高效、大容量的载体，发现新的功能基因，采用基因治疗与放疗、化疗联合等综合治疗方法才是肝癌基因治疗发展的方向。人类和啮齿动物的肝癌和癌前病灶在形态、生物化学、生物学指标上诸多的共同点表明，PHC的致病机制在不同物种间是基本类似的，因此，肝癌动物模型在基因治疗的发展和评估中发挥着极其重要的作用。在实验室研究阶段，通过应用动物模型模拟肝癌发生、发展过程，探索相关的治疗策略、技术，提出可行方案。在临床前研究中，通过在动物模型整体水平上进行基因治疗试验，对基因治疗方案的可行性、有效性、安全性以及免疫反应的评估，可大大提高临床试验的安全性和可靠性[17]。然而，在动物模型中无法复制在约80%肝癌患者中仍然存在的进展期的肝炎和肝硬化，因此，动物实验研究证实有效的基因治疗方案在临床应用中不一定有效，临床治疗的可靠性和一致性还需进一步验证和完善。

参  考  文  献

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（收稿日期：2011-06-28）     

（本文编辑：朱红梅）

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