HBV相关肝细胞癌患者核因子κB异常情况及其临床意义

【关键词】  癌，肝细胞； 核因子-κB； 肝炎病毒，乙型； 酶联免疫吸附测定

Abnormality of NF-κB expression and the clinical implications in patients with HBV-related hepatocelluar carcinoma   WU Wei, YAO Deng-fu, DONG Zhi-zhen, BIAN Yin-zhu, YAO Ning-hua, QIU Li-wei, YANG Jun-ling, SAI Wen-li.

【Key words】     Carcinoma, hepatocellular;    Nuclear factor kappa B;    Hepatitis B virus;    Enzyme-linked immunosorbent assay

【First author抯 address】   Research Center of Clinical Medicine, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong, Jiangsu Province 226001, China

Corresponding author: YAO Deng-fu, Email: yaodf@ahnmc.com

核因子-κB（NF-κB）是与免疫球蛋白κ轻链增强子B区结合，具有和某些基因上启动子区固定核苷酸序列结合而启动该基因转录的蛋白质，激活的NF-κB，在炎症相关性肝癌（HCC）中高表达，在肝细胞慢性炎症和癌变之间起桥梁作用[1]。我们用酶联免疫吸附法（ELISA）及实时定量PCR法分析了人肝癌组织及肝病患者外周血中NF-κB的表达，以探讨其在肝癌诊断、转移预测和鉴别诊断中的临床价值。

一、资料与方法

1. 标本来源：在2007年1月-2009年12月间，收集南通大学附属医院住院及门诊患者血标本，其中肝癌95例（男性85例，女性10例，平均年龄52岁），经临床、甲胎蛋白（AFP）、影像学（B型超声、CT或MRI检查）和（或）病理学确诊，其中Child-Pugh分类A、B和C级各58例、24例和13例， 肝硬化48例（男32例，女16例，平均年龄46岁），慢性肝炎32例（男22例，女10例，平均年龄48岁），另外收集健康献血员血标本40例（男女各20例，平均年龄32岁）作为正常对照组。所有患者及正常对照均同时检查肝、肾功能。另按自身配对法收集肝癌患者35例（男29例，女6例，平均51岁）术后新鲜肝组织，分别留取肝癌切除后的癌灶、癌周组织（距癌灶边缘5cm），除部分作病理学检查外，其余置-85℃保存备用。肝癌肿块直径≥5cm有7例，<5cm有28例（其中<3.0cm者18例）。经病理学（HE染色）证实其类型均为肝细胞肝癌，高、中和低分化分别为7例、22例及6例；肿瘤单发者30例，≥2个者5例。诊断及临床分期符合第八届全国肝癌学术会议的“原发性肝癌的临床诊断与分期标准”[2]。

2. 外周血单个核细胞制备：空腹静脉血5ml加2.5ml淋巴细胞分离液，离心，吸取单个核细胞层，锥虫蓝染色，取2×105个细胞，-80℃保存备用。

3. 免疫组织化学法：按说明书操作。肝组织中NF-κB表达强度，以阳性细胞数≥10%作为阳性判断标准，弱阳性（+）：阳性细胞数为10%～25%；阳性（++）：阳性细胞数为26%～75%；强阳性（+++）：阳性细胞数>75%。

4. HBV DNA检测：肝癌组织经中性甲醛固定，蛋白酶K消化，加HBV DNA探针过夜，加蛋白阻断液，滴加羊抗鼠生物素IgG，加入碱性磷酸酶标记的结合物，加入溴氯羟吲哚磷酸盐/氮蓝四唑染色，蒸馏水冲洗，复染封片。

5. 肝组织核蛋白及总RNA提取：称取肝组织50mg，剪成细小的组织碎片置于经高压灭菌的匀浆器中，再按细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒(碧云天生物技术有限公司)的使用说明进行操作，另取肝组织50mg置于无RNA酶匀浆器中，加入Trizol RNA抽提试剂匀浆，氯仿，异丙醇，乙醇等制备总RNA。在蛋白核酸分析仪上测定A260和A280值，比率在1.8～2.0之间。

6. 肝组织NF-κB定量：NF-κB活性测定按TransAM（Active Motif提供）的具体说明进行，测定A450nm的吸光度值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

7. PCR扩增引物设计：以GenBank中人NF-κB/p65 mRNA全长序列（NM-021975），用Premier5.0软件设计PCR引物，NF-κB/p65-P1为5′-AGCACAGATACCA CCAAGAC-3′，NF-κB/p65-P2为5′-TGGTCCCGTGA AATACACCT-3′，NF-κB/p65-probe为5′-AGTGTGT GAAGAAGCGGGACCTG-3′，扩增长度为543bp。以GAPDH作为内参基因，GAPDH-P1为5′-AGAAGGCTGG GGCTCATTTG-3′，GAPDH-P2为5′-AGGGGCCATCC ACAGTCTTC-3′，扩增长度为258bp。

8. NF-κB/p65-cDNA合成及荧光定量PCR：在预冷EP管内加入1μg总RNA和0.5μg/μl随机引物（Oligo-dT18），DEPC水至12μl，离心，70℃ 5 min，冰浴，离心；加4μl 5×反应缓冲液，1μl核酸酶抑制物（20U/μl）和2μl dNTP mix（10mmol/L），离心，37℃ 5min，冰浴；加1μl逆转录酶（20U/μl）。于42℃ 60min，70℃ 10min，合成cDNA。定量扩增体系：1μl cDNA（0.1μg/μl）；引物P1和P2（20μmol/L）各0.5μl；12.5μl PremixTaq，加ddH2O至25μl。在Bio-Rad荧光定量PCR仪上，94℃ 4min；94℃ 30s、60℃ 1min，重复2～3步骤40个循环后打印出拷贝数。

9. 统计学方法: 以Stata10.0.0统计软件分析和处理数据。数据以均数±标准差（x-±s）表示，采用配对t检验，计数资料以χ2检验或Fisher确切概率法分析和处理，以P<0.05表示差异有统计学意义。

二、结果

1. 肝癌组织NF-κB表达与HBV复制关系：NF-κB阳性表达呈棕黄色颗粒，肝癌组胞质和胞核均呈阳性，对应癌周组表达主要定位于胞质。NF-κB阳性率，肝癌组为100.0%，癌周组为68.6%；且表达强阳性前者51.4%，后者占11.4%；癌组NF-κB阳性率及强度均明显高于癌周组（图1A、Ｂ，P＝0.003）。所测肝癌组均有NF-κB表达，但HBV DNA阳性组和阴性组间，癌组NF-κB比浓度（ng/mg）及表达强度比较，t＝4.735，P<0.01；z＝4.551，P<0.01，差异有统计学意义，见图1C。HBV DNA阳性组23例中，其表达强度均在中等阳性以上，以强阳性表达为主（78.3%）；HBV DNA阴性组12例中，其表达强度以中等阳性表达为主，未见强阳性表达病例。

2. 外周血NF-κB基因扩增与标准曲线：采用实时定量PCR法成功地扩增了不同肝病外周血中NF-κB基因片段，见图2。

3. 肝病患者外周血NF-κB基因定量分析的临床价值： 实时定量PCR结果显示正常对照组为（0.36 ± 0.14）×105拷贝/μl、慢性肝炎组为（7.86 ± 2.51）×105拷贝/μl、肝硬化组为（8.44 ± 2.47）×105拷贝/μl、肝癌组为（42.60 ± 32.5）×105拷贝/μl，肝癌组患者NF-κB拷贝数明显高于其他组，F＝73.29，P<0.01，差异有统计学意义。肝硬化与正常对照相比，t＝20.64，P<0.01；慢性肝炎与正常对照相比，t＝18.89，P<0.01，差异均有统计学意义。肝硬化和慢性肝炎组比较，t＝1.02，P＝0.309，差异无统计学意义。         

4. 肝癌患者外周血NF-κB表达的病理学特征：血NF-κB表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、AFP浓度，差异无统计学意义。血NF-κB表达与HBV DNA阳性有关。术后肝癌及肝外转移的外周血标本检测结果显示，术后NF-κB表达会明显下降，转移复发又会明显升高，见表1。

三、讨论

NF-κB在炎症与肝细胞恶性转化过程中起桥梁作用，是调控癌细胞凋亡，调节肿瘤的新血管生成与侵袭能力的主要因子。激活的NF-κB在肝细胞增殖和凋亡中扮演重要角色，可参与癌症的启动、发生及发展过程，在炎性相关的恶性肿瘤呈高表达[3]。在诱癌过程中随肝细胞癌变的发生，肝组织中NF-κB表达愈来愈高。在肝细胞变性组，NF-κB表达的总体趋势已明显高于对照组；在肝细胞发生癌变时， NF-κB表达达高峰[4]。

我们分析了人HCC及配对癌周组织中NF-κB表达特点，显示NF-κB表达在癌组织为100%，明显高于癌旁组织，其强度在癌组织亦明显高于癌周组织，癌组织NF-κB阳性率及强度与分化程度、肿瘤数目、直径均未见明显统计学差异。NF-κB表达定位分析显示，在癌组织中有点灶状的胞核阳性，在癌周组未发现有胞核阳性，提示NF-κB在激活后进入胞核发挥其转录活性，参与肝癌的发生与发展。

HBx激活肝细胞中NF-κB信号途径的上游激酶，通过激酶的级联反应，使IκB-α磷酸化并降解，NF-κB移位入核内行使转录功能。HBx还可以抑制IκB-α进入胞核内和NF-κB结合而重新形成无活性的三聚体[5]。肝癌组及癌周组NF-κB定量分析，肝癌组NF-κB比浓度明显高于癌周组；HBV DNA阳性组和阴性组之间，NF-κB比浓度及表达强度差异明显。可通过血清学监测HBV DNA拷贝数，积极抗病毒治疗，抑制NF-κB异常活化，预防或延缓HCC形成。实时定量PCR检测了肝病患者血NF-κB含量，在正常对照、慢性肝炎、肝硬化及肝癌患者血中均有NF-κB表达，以肝癌患者明显高于其他组，肝硬化、慢性肝炎也高于正常对照，但肝硬化和慢性肝炎组间无显著差异。NF-κB激活是炎症反应的标志，病毒感染刺激NF-κB表达并使其DNA结合能力增强。提示NF-κB在炎性相关的恶性肿瘤高表达，为炎症与肿瘤的启动提供了桥梁作用。

肝癌切除仍是治疗肝癌的有效手段，但由于部分肝癌患者术前血循环中已存在少量癌细胞，在机体免疫功能遭受破坏情况下，血中癌细胞得以增殖，使肝癌术后复发率高，甚至小肝癌也如此。本研究中，对95例肝癌患者血清NF-κB表达的病理学特征进行了分析，发现血中NF-κB表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤大小、AFP浓度无关，而与HBV感染明显相关。对64例手术后的肝癌血标本以及40例转移复发的肝癌血标本进行了NF-κB含量检测，发现在手术后NF-κB表达会明显下降，转移复发又会明显升高，提示HBV异常激活NF-κB从而促进肝癌发生和发展，NF-κB的测定不仅是诊断肝癌的有用指标，也可作为判断肝癌预后的参考指标。抑制NF-κB的活性可以抑制肝癌[6]；如果同时给予化疗药物则能增强化疗药物的作用效果。NF-κB活化干预可望成为炎症相关肝癌治疗的新靶点。

参  考  文  献

[1]Kim HR, Lee SH, Jung G. The hepatitis B viral X protein activates NF-kappaB signaling pathway through the up-regulation of TBK1. FEBS Lett, 2010, 584: 525-530.

[2]Liver Cancer Committee of Chinese Anti-cancer Association. The criteria of clinical diagnosis and stage classification for primary hepatic carcinoma. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2001, 9: 324. (in Chinese)

中国抗癌协会肝癌专业委员会. 原发性肝癌的临床诊断与分期标准.中华肝脏病杂志,2001,9:324.

[3]Jiang R, Xia Y, Li J, et al. High expression levels of IKKalpha and IKKbeta are necessary for the malignant properties of liver cancer. Int J Cancer, 2010, 126: 1263-1274.

[4]Wu W, Yao DF, Qiu LW, et al. Characteristics of hepatic nuclear-transcription factor-kappa B expression and quantitative analysis in rat hepatocarcinogenesis. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2009, 8: 504-509.

[5]Cho HA, Park IS, Kim TW, et al. Suppression of hepatitis B virus-derived human hepatocellular carcinoma by NF-kappaB-inducing kinase-specific siRNA using liver-targeting liposomes. Arch Pharm Res, 2009, 32: 1077-1086.

[6]Wu W, Yao D, Wang Y, et al. Suppression of human hepatoma (HepG2) cell growth by nuclear factor-kappaB/p65 specific siRNA. Tumour Biol, 2010, 31: 605-611.

（收稿日期：2010-07-29）

（本文编辑：袁平戈）

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