免疫性和酒精性肝纤维化大鼠肝脏细胞质膜的蛋白质组学研究

【摘要】  目的  研究肝纤维化的发生机制，寻找新的与肝纤维化相关的生物学标志物。 方法  将48只大鼠分为乙醇组、免疫组和对照组，分别进行乙醇灌胃、猪血清注射与等渗盐水注射处理。采用James’s网状染色法染色并检测处理后第2、4、6、8周大鼠肝脏的病理学变化。将处理后第2、4、6、8周的各组大鼠分别处死4只后取肝，并将肝脏组织作匀浆处理，通过2次蔗糖密度梯度离心获得细胞质膜组分，用Western blot法检测细胞质膜的纯度。提取肝脏细胞质膜蛋白质，通过双向凝胶电泳分析各个时期的大鼠肝脏细胞质膜蛋白质，差异蛋白质点在酶解后经戴安纳升级液相色谱Ultimate 3000串联布鲁克高容量离子阱质谱HCT进行鉴定。并对被鉴定的差异蛋白质进行功能和定位的分类分析。 结果  大鼠肝脏细胞质膜得到了有效富集。双向凝胶电泳分析第2周和第8周的大鼠肝细胞质膜蛋白质，共找到87个差异蛋白质点，这些蛋白质点经过质谱鉴定后对应于30个非冗余蛋白质，包括膜联蛋白A2，细胞支架角蛋白8和18。 结论  膜联蛋白A2、细胞支架角蛋白8和18等蛋白质可成为肝纤维化诊断的新标志物。

【关键词】  肝硬化； 大鼠； 模型，免疫学； 蛋白质组

Subcellular proteome analysis of immune or alcohol induced rat liver fibrosis   JIA Xiao-fang, PENG Xia, FENG Yan-ling, YANG Hua, YUAN Zheng-hong, ZHANG Li-jun. Shanghai Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University, Shanghai 201508, China

Corresponding author: ZHANG Li-jun, Email: zhanglijun1221@ 163.com

【Abstract】 Objective    To study the mechanism of liver fibrogenesis and  to find new non-invasive biomarkers. Method    In this study, we used subcellular proteomic technology to study the plasma membrane proteins related to immune or alcohol induced liver fibrosis. Rat liver fibrosis models were induced by pig serum or alcohol injection. The liver fibrogenesis were detected by James’s staining in the rat models after 2, 4, 6 and 8 weeks of treatment. The liver plasma membrane (PM) of the 2- and 8-week treatment model rats were enriched by two-step sucrose density gradient centrifugation. The purity of PM was verified by western blotting, and the plasma membrane proteins were extracted and analyzed by 2 DE. The differentially expressed proteins were identified by LC-MS/MS. Cellular location and function of these identified differential protein were classified. Results    Immune or alcohol induced liver fibrosis rat models were successfully established. Liver plasma membrane was significantly enriched after sucrose density ultracentrifugation treatment. 87 differential protein spots were find out by 2DE combined with LC-MS/MS from the liver plasma membrane proteins of the 2- and 8-week treatment rat models, which corresponded to 30 non-redundant proteins including annexin A2, keratin 8 and keratin 18. Conclusions    A list of differentially expressed proteins relate to liver fibrosis were successfully identified. Differential proteins such as annexin A2, keratin 8 and keratin 18 could be new biomarkers for liver fibrosis diagnosis.

【Key words】Liver cirrhosis; Rats; Models, immunological; Proteome

在已发现的肝纤维化药物作用靶标中，约有70%是细胞质膜蛋白质。研究肝纤维化动物的肝脏细胞质膜蛋白质组,寻找与肝纤维化相关的细胞质膜蛋白质,对我们揭示肝纤维化的机制,寻找与肝纤维化相关的诊断学标志物有重要意义。

材料与方法

1. 实验动物、仪器与试剂：无特定病原体级SD大鼠48只，体质量180～200g，雌雄各半，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司；猪血清购自广东蕊特生物公司；分析纯规格乙醇购自上海国药集团化学试剂有限公司；小鼠源细胞质膜标志蛋白质钠钾三磷酸腺苷酶抗体和线粒体标志蛋白质抑制素蛋白抗体均购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠第二抗体购自美国Millipore公司；蔗糖、胰酶均购自美国Sigma公司；固相pH梯度干胶条和强化化学发光法试剂盒、等电聚焦缓冲液、IPGphor等电聚焦仪均购自美国GE公司；3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、二硫苏糖醇、苯甲基磺酰氟、NP-40、丙烯酰胺、N，N′-甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙二胺四乙酸二钠、尿素、硫脲、甘油均购自美国Amresco公司；色谱纯乙腈和甲酸均购自美国Merck公司；电动匀浆器购自墨西哥Biospec公司；超速离心机购自美国贝克曼公司；电泳仪、垂直平板电泳系统均购自美国Bio-Rad公司；C18预柱、C18反向柱和Ultimate 3000型纳升级液相色谱均购自美国戴安公司；高容量离子阱HCT质谱仪购自德国布鲁克公司。

2. 肝纤维化动物模型的建立：将48只大鼠经适应性饲养3d后随机分为免疫组16只，腹腔注射0.5ml猪血清，2次/周；对照组16只，腹腔注射0.5ml等渗盐水，2次/周；乙醇组16只，每天用60%乙醇10ml/kg、橄榄油2ml/kg和吡唑25mg/kg灌胃[1]。分别于第2、4、6、8周末，每组处死大鼠4只，取肝左叶约0.5cm×0.5cm×0.5cm肝组织，用4%甲醛固定，石蜡包埋、切片，经Jame’s网状纤维染色后在光镜下进行组织病理学观察。

3. 肝脏细胞质膜纯化及细胞质膜蛋白质的提取：第2周和第8周的模型大鼠肝组织除用于病理学检查外，剩余的肝组织按取材时期合并，进行后续的肝脏细胞质膜提取实验。采用两次蔗糖密度梯度离心法分离纯化大鼠肝细胞质膜，方法参照文献 [2]。大鼠饥饿18～20h处死后，用等渗盐水进行肝脏灌流，去除血细胞至肝脏变白，将肝脏取下，去掉大的血管，剪碎成约2.5mm×2.5mm×2.5mm的小块，加入预冷的匀浆液至组织与匀浆液的体积比为1∶2，匀浆液的成分为0.25mol/L蔗糖、10mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和1mmol/L乙二胺四乙酸二钠，pH值为7.5，将样品置于冰上，使用电动匀浆器以5000r/min匀浆30s，重复4次，至组织液化得到匀浆组分。匀浆组分经4层纱布过滤，滤液于4℃以1500×g离心10min，收集沉淀。用质量百分比浓度为60%的蔗糖溶液充分悬浮沉淀，至蔗糖终浓度为44%，置于SW-32离心管中，离心管上部铺以42.3%的蔗糖溶液，于4℃以100000×g离心2.5h，收集顶层膜层。用匀浆液溶解该膜层，再用60%的蔗糖溶液调节该混合物使其蔗糖终浓度为44%。转移入SW-32管，并依次铺上42.3%、41.0%、39.0%和37.0%的蔗糖溶液。于4℃以100000×g离心6h后，收集漂浮在37.0%的蔗糖上层的细胞质膜组分。将细胞质膜组分用匀浆液重新悬浮后保存于-80℃，以备用于蛋白质组学研究。将分装的细胞质膜悬液冰上化冻后，以14000r/min离心30min，使细胞质膜沉淀，去掉上清液后，按体积比1∶1加入双向裂解液，裂解液的成分为8mol/L 尿素、2mol/L硫脲、4% 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、0.1% NP-40、65mmol/L二硫苏糖醇、0.5mmol/L苯甲基磺酰氟和0.1% pH值为3～10的等电聚焦缓冲液，冰上裂解30min后，室温裂解30min，每隔10min震荡1次。用Bradford法测定蛋白质含量，分装提取的蛋白质样品，冻存于-80℃冰箱。

4. Western blot法检测细胞质膜的纯度和差异蛋白质的表达：将细胞质膜特异蛋白质钠钾三磷酸腺苷酶抗体按1∶1000稀释，抗体稀释液为5g脱脂奶粉溶于100ml三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液，线粒体特异蛋白质抑制素蛋白质抗体用抗体稀释液按1∶2000稀释，与转印膜室温孵育1h。第二抗体采用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体用抗体稀释液按1∶500稀释后，与转印膜室温孵育30min，采用强化化学发光法试剂盒进行检测。通过定量软件Image J对免疫印迹条带的信号强度作半定量分析，根据不同条带的灰度值绘制灰度曲线，计算曲线下面积作为条带的定量根据。

5. 蛋白质双向电泳分离和差异蛋白质的质谱鉴定：按参考文献[2]报道的方法，第一向等电聚焦电泳采用pH值为3～10的非线性胶条，电泳程序设置如下：水化：30V，12h；电泳：500V，1h；1000V，1h；8000V，30min，电压梯度递增；8000V，5h；总功率达44千瓦。第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，分离胶浓度为11.5%。电泳完后，剥胶，用考马斯亮蓝染色。2-DE胶用Image scanner扫描仪成像。所得图像用ImageMaster 2D Platinum 6.0软件将电泳图谱分成2个类别进行找点、匹配等分析。即乙醇组与对照组的第2周和第8周分别进行图像分析比较，免疫组与对照组第2周和第8周分别进行图像分析比较，选择各组中二维凝胶电泳分离效果好、点数多的一块胶作为参考胶，进行平行组间的匹配分析，筛选出在半数胶中均存在的≥2倍及其以上的差异点。取差异蛋白质点脱色脱水冻干后，各管中加入0.02g/L的胰酶5μl。于37℃酶解16～18h，用戴安Ultimate 3000型纳升级液相色谱串联布鲁克高容量离子阱质谱HCT进行分析鉴定。鉴定方法为酶解后的样品先经过内径与长度为300μm与5mm, 填料颗粒直径为5μm的C18预柱脱盐，流速为20μl/min，流动相为含2%色谱纯乙腈和0.1%甲酸溶液。然后以300nl/min的流速经内径与长度为75μm与15cm, 填料粒径为3μm的C-18反向柱进行分离，色谱的梯度为4%～48%乙腈，色谱梯度分离的时间为40min。通过C18色谱柱分离的肽段由纳流喷针进入HCT质谱进行实时的离子化分析检测。HCT质谱每秒进行1次一级扫描和5次二级扫描分析。用DataAnalysis 3.2软件整合肽指纹图谱和串联质谱二级图谱，通过Mascot软件查询SwissPort数据库。搜库参数如下：一级质谱MS的误差为±1.2，二级质谱MS/MS的误差为±0.6；固定修饰为半胱氨酸被修饰成脲甲基半胱氨酸，可变修饰为甲硫氨酸氧化；每个肽段允许有1个不完全酶切位点；样品的物种来源为大鼠；质谱仪离子源产生+1，+2，+3价的离子；质谱数据模式为单同位素峰；数据库检索的置信区间为95%；蛋白质的Mascot搜库得分＞36分为鉴定结果可靠。通过Expasy数据库检索鉴定的非冗余蛋白质的功能和定位信息，并进行分类。

结    果

1. 病理学检测结果：对照组大鼠腹腔注射等渗盐水后第2、4、6、8周的肝组织显微镜检查情况基本相同，肝小叶及门管区肝组织结构未发现明显病变；免疫组大鼠腹腔注射猪血清后第2周与对照组比较，除2例门管区见少量纤维细胞增生外，其余未发现明显病变，从第4周到第8周肝纤维化的程度逐渐加强，至第8周时纤维组织明显增生，向肝小叶内蔓延，有假小叶形成；乙醇组从第4周起开始有轻微的肝纤维化发生，至第8周肝纤维化程度严重，且伴随较明显的脂肪变，见图略。

2.Western blot法检测细胞质膜纯度：在细胞质膜特异蛋白质钠钾三磷酸腺苷酶的信号强度细胞质膜比匀浆组分富集了20.7倍，而线粒体特异抑制素蛋白质的信号强度在细胞质膜为匀浆组分的28.6%，见图略。

3. 差异蛋白质组分析：乙醇组、免疫组和对照组肝脏细胞质膜双向电泳图中检测到蛋白质点的个数分别为688±51、578±36和547±45。共找到87个差异蛋白质点，其中乙醇组第2周差异点为17个，第8周差异点为30个，免疫组第2周差异点为20个，第8周差异点为20个。第2和第8周乙醇组和对照组大鼠肝细胞质膜蛋白质的双向电泳结果见图略，免疫组和对照组大鼠肝细胞质膜蛋白质的双向电泳结果见图4。

4. 差异蛋白质的鉴定：图像分析后找出的87个差异蛋白质点中有52个蛋白质点得到准确鉴定，而这52个差异蛋白质点共对应于30个非冗余蛋白质结果，见表1。

5. 鉴定的差异蛋白质的功能和定位分析：根据Expasy数据库的资料，鉴定的差异蛋白质中有40%明确定位在细胞质膜上,包括细胞骨架蛋白，13%定位于线粒体，10%位于内质网，10%位于细胞核，17%位于细胞质，3%为分泌蛋白质，7%的蛋白质定位信息不明。对鉴定的30个非冗余差异蛋白质进行功能分类，有52%的蛋白质为结合蛋白，22%的蛋白质具有酶活性。3%的蛋白质为伴侣蛋白质，6%为信号传导蛋白质，6%为转运蛋白质，8%为结构蛋白质，还有3%的蛋白质功能不明。

讨    论

基于二维凝胶电泳结合质谱鉴定的蛋白质组学技术，已经广泛的应用于寻找与肝病发生机制相关的标志蛋白质的研究，但很少做到肝脏亚细胞器水平[3-4]。本研究通过腹腔注射猪血清或乙醇灌胃处理，构建了大鼠免疫性和酒精性肝纤维化模型，并通过两步蔗糖密度梯度离心法，有效地富集了肝脏细胞质膜组分。通过从大多数药物的作用靶点细胞质膜蛋白质入手，采用蛋白质组学的技术路线鉴定了一批在免疫性和酒精性肝纤维化过程中发生变化的肝细胞质膜差异蛋白质。主要包括细胞支架角蛋白8和18、三磷酸腺苷合酶、肌球蛋白-9、膜联蛋白A3和A2等。细胞骨架蛋白如Ⅰ型细胞支架角蛋白18和Ⅱ型细胞支架角蛋白8等，其主要作用就是保护肝实质细胞免受各种压力造成的细胞损伤，其功能缺失或者发生突变将使肝脏易受到伤害，发生肝硬化等病变[4]。膜联蛋白A2在细胞内参与膜形成、膜转运、胞吞、胞吐、细胞增殖、信号转导、分化及凋亡等一系列重要的生命过程，有研究发现该蛋白质与肝纤维化和肝癌等疾病密切相关，随纤维化程度的发展而增高,与肝组织损伤和肝纤维化活动呈正相关[5-6]。其他的蛋白质与肝纤维化的联系机制暂不明确，需要我们做进一步的鉴定和验证。

参  考  文  献

[1]Wang L, Ji G, Zheng PY, et al. Establishment of a rat model of alcoholic liver fibrosis induced by complex factors. Zhongxiyi Jiehe Xuebao, 2006, 4: 281-284. (in Chinese)

王磊，季光，郑培永，等.大鼠酒精性肝纤维化复合模型的建立.中西医结合学报,2006,4:281-284.

[2]Zhang LJ, Wang XE, Peng X, et al. Proteomic analysis of low-abundant integral plasma membrane proteins based on gels. Cell Mol Life Sci, 2006, 63: 1790-1804.

[3]Li X, Pan W, Qiu F, et al. Two-dimensional gel electrophoresis of subcellular fractions of hepatoma cells. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 271-273. (in Chinese)

李兴，潘卫，邱峰,等.肝癌细胞亚细胞组分的双向凝胶电泳分析.中华肝脏病杂志，2005,13:271-273.

[4]Peng X, Jia XF, Zhou WJ, et al. Proteomic analysis of plasma membrane of HBV transgene mice livers. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2008, 16: 590-593. (in Chinese)

彭霞，贾小芳,周文江,等.乙型肝炎病毒基因调控的小鼠肝细胞质膜蛋白质变化.中华肝脏病杂志,2008,16:590-593.

[5]Zhong B, Strnad P, Selmi C, et al. Keratin variants are overrepresented in primary biliary cirrhosis and associate with disease severity.Hepatology, 2009, 50: 546-554.

[6]Mohammad HS, Kurokohchi K, Yoneyama H, et al. Annexin A2 expression and phosphorylation are up-regulated in hepatocellular carcinoma. Int J Oncol, 2008, 33: 1157-1163.

（收稿日期：2010-03-20）

（本文编辑：孙宇航）

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