核苷（酸）类似物导致乙型肝炎病毒聚合酶区基因耐药变异的影响因素

【关键词】  肝炎病毒，乙型； 耐药； 核苷(酸)类似物； 影响因素

Analysis on influential factors of nucleoside analogues anti-HBV therapy induced drug-resistance mutants in polymerase gene of HBV   YANG Fang, ZHANG Ming-xiang, WEI Ni, JU Ying.

【Key words】     Hepatitis B virus;    Resistance;    Nucleoside/tide analogues;    Influential factors

【First author抯 address】   Shenyang Municipal Infectious Disease Hospital, Shenyang 110006, China

Corresponding author: WEI Ni, Email: weini0327@163.com

HBV耐药管理的策略从发生临床耐药时间点前移至发生病毒学突破时间点再前移至病毒学应答不满意，将来可能发生耐药的时间点最终则应前移至治疗起点[1]。因此，尽早预测并及时发现HBV基因耐药对于提高疗效以至改变疾病预后具有重要的意义。本研究对核苷（酸）类似物（NAs）抗病毒治疗导致HBV DNA聚合酶区基因耐药变异的影响因素进行了分析。

一、资料与方法

1．患者来源：2006年5月-2008年5月在沈阳市第六人民医院住院且正在接受NAs抗病毒治疗的慢性乙型肝炎及其相关肝硬化患者107例，治疗中位疗程72周（35～501周）。入院后详细记录患者的病史、家族史和饮酒史等，患者均有完整的NAs治疗史记录。取血清标本进行HBV DNA聚合酶区基因分析，同时行肝功能生物化学、血常规、凝血功能、HBV DNA定量、HBeAg定量检测及蛋白质电泳、肝脏超声检查。

2．肝功能检测：采用美国Abbott公司生产的全自动生物化学分析仪检测肝功能；HBeAg定量采用酶促免疫荧光法，仪器为美国Abbott公司生产的全自动酶免分析仪；HBV DNA定量采用荧光定量实时聚合酶链反应（PCR）法，仪器为美国MJ公司生产的Opticon基因扩增仪（检测下限为1.0×103拷贝/ml），试剂由深圳匹基公司提供。

3．HBV DNA聚合酶区基因测序：采用北京天泽基因工程公司生产的病毒DNAout试剂抽提HBV基因组，引物由我院实验室自行设计，包括介导PCR反应的内、外引物各2组，PCR扩增病毒聚合酶逆转录酶区，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收纯化后，采用美国ABI公司3130全自动DNA测序仪上机电泳测序，结合每一对正向及反向序列，与存储在HBV基因库的参考序列自动比对从而获得样本的突变位点。

4．统计学分析：数据用SPSS13.0软件分析，首先进行单因素分析，符合正态分布计量资料用t检验，否则采用秩和检验；计数资料用卡方检验；将单因素分析与NAs抗病毒耐药变异有关的影响因素代入Logistic回归方程（极大似然后退法）进行多因素分析；P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1．一般资料：107例进行耐药基因检测者中，男性95例（88.8%），女性12例（11.2%），中位年龄45（21～78）岁。单用拉米夫定者73例（68.2%），单用阿德福韦酯者15例（14.0%），单用恩替卡韦者9例（8.4%），先拉米夫定后阿德福韦酯联合治疗者6例（5.6%），先拉米夫定后序贯阿德福韦酯治疗者1例（0.9%），先阿德福韦酯后序贯替比夫定治疗者1例（0.9%），拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定和恩替卡韦序贯治疗者2例（1.9%）。序贯治疗和联合治疗均在出现病毒耐药（耐药定义为血清HBV DNA载量比获得应答后的最低值上升＞1log10拷贝/ml或通过基因测序发现耐药基因变异）时使用。

2．耐药检测结果：本组患者中共44例（41.1%）发生耐药，其中33例（30.8%）检测到基因耐药变异位点，耐药位点检出率为75%。33份检测到基因耐药变异的血清标本中，L180M、A181T、S202I、V173L＋Ll80M＋M204V和S202I＋M204V变异各1份，M204V变异5份（15.2%），M204I变异8份（24.2%），M204V/I＋L180M变异15份（45.5%），变异模式见表1。

表1  33例基因耐药变异模式及构成比

治疗药物       病例数    变异模式       例数       构成比(%)

单用拉米夫定       28    L180M    1    3.6

              S202I      1    3.6

              M204V   5    17.8

              M204I     7    25.0

              M204V/I+L180M   12    42.9

              V173L+Ll80+M204V    1    3.6

              S202I+M204V       1    3.6

单用ADV      1    A181T    1    -

先LAM后联合ADV    1    M204V+L180M     1    -

先LAM后ADV序贯   1    M204I     1    -

先ADV后Ldt序贯      1    M204I+L180M      1    -

 LAM、ADV、    1    M204I+L180M      1    -

Ldt和ETV序贯

  注：LAM：拉米夫定；ADV：阿德福韦酯；Ldt：替比夫定；ETV：恩替卡韦

3．分组比较单因素分析：按是否发生耐药分为耐药组（n＝44）和未耐药组（n＝63），比较可能与耐药相关的因素。结果显示年龄、性别、乙型肝炎家族史、大量饮酒史、糖尿病史、肝病严重程度（是否合并肝硬化）、确诊HBV感染时间以及γ-谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶、胆碱酯酶、白蛋白、总胆红素、凝血酶原时间、γ球蛋白、HBeAg定量、白细胞计数、血小板计数和脾面积的差异无统计学意义；而合并脂肪肝、抗病毒用药持续时间、ALT、AST、总蛋白、HBV DNA水平，两组间差异有统计学意义（表2）。

4．多因素Logistic回归分析：将单因素分析结果中与耐药有关的因素代入Logistic回归方程，结果显示合并脂肪肝、HBV DNA及AST水平是发生耐药的独立危险因素（表3）。

表3  影响耐药的多因素logistic回归分析结果

自变量      回归    标准       Wald       P值 比值         95%可信

         系数    差  值         比      区间

合并脂肪肝    1.968    1.123      3.069      0.039      7.158      1.792～64.731

AST水平       0.002    0.001      3.681      0.021      1.002      1.000～ 1.004

HBV DNA水平     0.366    0.184      3.951      0.042      1.442      1.005～ 2.068

常数项    -2.602     0.954      7.440      0.006       -       -

  注：ALT、用药时间、总蛋白分别在第2、3、4步被剔除

三、讨论

目前判断临床耐药的主要依据是依从性良好的患者在获得应答后血清HBV DNA反弹，同时伴或不伴有生物化学的突破。耐药变异株变为优势株主要与药物的选择性压力有关，理论上在发生临床耐药之前应检测到相关的耐药变异位点，但只有当耐药突变株达到病毒准种的20％以上时才能被检测到[2]。邓俊等[3]对227例出现临床耐药的慢性乙型肝炎患者的血清标本进行HBV DNA聚合酶区基因分析，仅有111例检测到已知耐药变异位点，已知耐药位点检出率约为50%，低于本研究，可能与检测方法及所用试剂的敏感性及特异性不同有关，但是否存在尚未发现的耐药突变位点等其他原因仍有待进一步研究。

单因素分析结果发现，合并脂肪肝、NAs应用持续时间、HBV DNA及ALT、AST、总蛋白水平与耐药发生相关，进一步行多因素Logistic回归分显示，合并脂肪肝、HBV DNA及AST水平是发生耐药的独立危险因素。Minakari等[4]的研究结果显示，慢性乙型肝炎患者合并脂肪肝主要与宿主的代谢性因素有关。这可能影响NAs在患者体内的生物利用度，从而降低NAs的药物动力学屏障，导致耐药风险增加，但确切机制还须进一步研究。Shaw等[5]认为ALT水平升高时，肝细胞的再生快，预示着有更多的未被感染的肝细胞产生，即产生了很大的复制空间，也就是说ALT水平能预测是否容易产生耐药。本研究中单因素分析证实了该观点，虽然一般肝病患者ALT水平较AST更具有特异性，但AST水平更能反映肝损伤的严重程度，可以解释AST作为耐药独立危险因素的原因，提示治疗期间ALT及AST持续升高的患者发生耐药的风险加大。HBV DNA聚合酶缺乏自我校正能力，每年每个位点约有（1.4～3.2）×10-5个核苷酸置换率[6-7]，本研究提示应用NAs治疗的患者，治疗至少24周后HBV DNA水平是发生耐药的独立危险因素，也即是耐药不只与基线HBV DNA水平有关，与治疗过程中的动态变化也密切相关。因此，对于耐药基因屏障低的中等强度抗病毒药如拉米夫定或替比夫定，不应优先用作一线治疗，24周（或较晚时间点）的中间决策可能不重要，但应在治疗期间监测血清HBV DNA水平，在应答不充分患者中及时改变治疗策略[8]。

参  考  文  献

[1]Ren H. New concepts about management for HBV drug resistance. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2008, 16: 329-334. (in Chinese)

任红.乙型肝炎病毒耐药管理的新观念.中华肝脏病杂志,2008, 16:329-334.

[2]Lok AS, Zoulim F, Locarnini S, et al. Antiviral drug-resistant HBV: standardization of nomenclature and assays and recommendations for management. Hepatology, 2007, 46: 254-265.

[3]Deng J, Zhang DH, Yu DM, et al. Mutation patterns in the RT region of hepatitis B virus P gene in patients treated with nucleoside/nuckotide analogs. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2009, 17: 342-345. (in Chinese)

邓俊,张东华,于德敏,等.核苷（酸）类耐药患者中乙型肝炎病毒逆转录酶区基因变异类型及其特点.中华肝脏病杂志,2009,17:342-345.

[4]Minakari M, Molaei M, Shalmani HM, et al. Liver steatosis in patients with chronic hepatitis B infection: host and viral risk factors. Eur J Gastroenterol Hepatol, 2009, 21: 512-516.

[5]Shaw T, Bartholomeusz A, Locarnini S. HBV drug resistance: mechanisms, detection and interpretation. J Hepatol, 2006, 44: 593-606.

[6]Okamoto H, Imai M, Kametani M, et al. Genomic heterogeneity of hepatitis B virus in a 54-year-old woman who contracted the infection through materno-fetal transmission. Jpn J Exp Med, 1987, 57: 231-236.

[7]Girones R, Miller RH. Mutation rate of the hepadnavirus genome. Virology, 1989, 170: 595-597.

[8]Dienstag JL. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med, 2008, 359:1486-1500.

（收稿日期：2010-02-26）

（本文编辑：黄晨）

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