p38MAPK磷酸化对HepG2细胞耐药的影响及其意义

【摘要】  目的  探讨p38MAPK磷酸化对HepG2细胞耐药的影响及其意义。 方法  采用浓度递增法,建立动态HepG2/顺铂（CDDP）耐药模型，Western blot检测磷酸化p38的表达；予以p38MAPK特异性抑制剂SB203580分别处理24、48、72h后，流式细胞仪动态分析HepG2/CDDP耐药细胞周期、四甲基偶氮唑盐法检测顺铂对HepG2/CDDP耐药细胞的半数药物抑制浓度（IC50）、Western blot检测HepG2/CDDP耐药细胞凋亡分子Bcl-2、Bax及P-gp蛋白的表达。动态耐药模型磷酸化P38的检测行单因素方差分析；SB203580处理后计量资料行3×3析因设计方差分析，率的比较采用χ2检验。 结果  成功建立HepG2/CDDP耐药细胞株，其对CDDP的IC50值与对照HepG2细胞差异具有统计学意义（t＝99.30，P<0.01）；随着HepG2/CDDP耐药细胞株耐药表型的增强，P38MAPK活化水平逐渐增强（F＝69.39，P<0.01）。P38MAPK特异性抑制剂SB203580可逐渐降低HepG2/CDDP对顺铂的IC50值（F＝2350，P<0.01）、G0/G1期细胞比例（χ2＝520，P<0.01）、Bcl-2/Bax表达比值（F＝83.8, P<0.01）及细胞膜药物转运相关蛋白P-gp的表达（F＝107，P<0.01）。 结论  P38活化水平随着肝癌耐药细胞株耐药表型的增强而逐渐升高；抑制P38的活化可有效逆转肝癌HepG2/CDDP耐药细胞株的耐药性。

【关键词】  癌，肝细胞； 耐药性； 细胞周期； P38

Effectiveness of p38MAPK activity during drug resistance against HepG2   TANG Peng, CHEN Wei-qing, SHEN Wen-yong. Department of Digestive Diseases, Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China

Corresponding author: CHEN Wei-qing, Email: chenweiqing506@ yahoo.com

【Abstract】 Objective    To investigat the effectiveness of p38MAPK activity during drug resistance against HepG2. Methods    HepG2/CDDP kinetic anti-cancer drug resistance model was constructed using anti-cancer drug inducing method and treated with P38MAPK inhibitor SB203580 for 24, 48 and 72 hours respectively. Flow cytometry (FCM) was used to detect the cell cycle distribution. The IC50 of cisplatin was determined by MTT method in vitro. The expressions of P-P38, P-gp, Bcl-2 and Bax were examined by Western blot.  Retults    The HepG2/CDDP kinetic drug resistance model was successfully established. The expression of P-P38 increased with the increasing drug resistance against HepG2 cells. The models treated with SB203580 could gradually elevate the sensitivity of HepG2/CDDP to cisplatin, block the detention of cell cycle, up-regulate the expression of Bax and down-regulate the expressions of Bcl-2 and P-gp. Conclusion    The expression of P-P38 increased with the increasing drug resistance against hepatocellular carcinoma cells. Supressing  the activation of P38 could reverse the drug resistance phenotype against hepatocellular carcinoma cells.

【Key words】Carcinoma, hepatocellular; Drug resistance; Cell cycle; P38

P38由360个氨基酸组成，是相对分子质量为3.8×104的酪氨酸磷酸化蛋白激酶，可被磷酸化为P-P38而激活；P38MAPK信号途径是分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）级联信息传递系统的重要组成部分，经外界刺激应激激活，参与炎症、细胞应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程，近年发现该通路在消化系肿瘤发病、耐药、转移中起重要作用。我们拟通过抑制HepG2/顺铂（CDDP）耐药细胞株中P38的活性，探讨P38MAPK与HepG2/CDDP耐药细胞株耐药的相关性及可能的调控作用机制。

材料与方法

一、 材料及仪器

人肝癌细胞株HepG2细胞购自第三军医大学附属西南医院中心实验室；胎牛血清和1640培养液购自杭州四季青生物公司；胰蛋白酶，四甲基偶氮唑盐（MTT）和二甲基亚砜（DMSO），p38MAPK特异性抑制剂SB203580，兔抗人p38MAPK第一抗体、兔抗人磷酸化p38MAPK第一抗体、兔抗人Bax第一抗体、兔抗人Bcl-2第一抗体购自Santa Cruz公司；兔抗人P-糖蛋白（P-gp）第一抗体购自武汉博士德公司；辣根过氧化物酶标记第二抗体，电化学发光（ECL）试剂盒购自美国Santa Cruz公司；CO2细胞培养箱，超净工作台，酶标仪，蛋白电泳槽、电泳仪和转移槽购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

二、建立HepG2/CDDP动态耐药模型及检测其P38活化

1. HepG2/CDDP耐药细胞模型的建立与验证：采用低浓度逐步递增法，分别采用浓度为0.2～1.6mg/L的CDDP诱导HepG2细胞形成耐药，并传代培养，取能够维持在1.6mg/L CDDP下长期培养、稳定传代、生长状态良好的细胞，记为HepG2/CDDP-1.6,采用MTT法验证细胞对CDDP的敏感性；以SPSS10.0软件计算CDDP的半数致死量（IC50）。

2. Western Blot 检测HepG2/CDDP 动态耐药模型P38活化：取对数生长期HepG2/CDDP-1.6细胞，待贴壁生长24h后，加入含有2.0mg/L的CDDP的培养液并分别培养24、48、72h及5、7d，提取细胞总蛋白。采用Western blot法，转膜并在抗体中孵育后的聚偏氟乙烯膜经ECL显影，Quntity one图像分析软件采集分析结果，以总P38表达为内对照，计算P-P38/P38灰度比值。

3. 特异性抑制剂SB203580抑制P38活性并观测其对HepG2/CDDP动态耐药模型的影响：（1）实验处理及分组：采用P38特异性抑制剂SB203580处理耐药细胞，抑制P38活性；取对数生长期HepG2/CDDP-1.6细胞分为3组：HepG2/CDDP组（对照组）未进行干预；HepG2/CDDP-DMSO组（DMSO对照组）加入0.1% DMSO；HepG2/CDDP-SB203580组（SB203580干预组）加入10μmol/L SB203580；将以上各组细胞置于含2.0mg/L CDDP的1640培养基中分别培养24、48、72h,收集不同时间点细胞进行检测。（2）MTT检测各组细胞对顺铂的半数抑制浓度：将收集的细胞按4×104个／ml的浓度接种至96孔板，每组设4个复孔，以倍比稀释成5个浓度梯度的CDDP处理，按常规MTT法操作，自动酶标平板阅读仪以490nm波长读取吸光度(A)值, SPSS10.0软件计算各组细胞对顺铂的IC50值。（3）流式细胞仪检测各组细胞周期：每样本采集至少2×105个细胞并固定，送第三军医大学中心实验室流式细胞仪室行细胞周期检测。采用 CellQuest sofeware（Becton Dickinson）分析数据。（4）Western blot检测各组凋亡相关分子及P-gp的表达：提取各样本总蛋白，采用Western blot法，转膜并抗体孵育后的聚偏氟乙烯膜经ECL显影，Quntity one图像分析软件采集分析结果，以β-肌动蛋白为内对照，计算Bcl-2、Bax及P-gp与β-肌动蛋白灰度比值。

三、 统计学处理

数据以均数±标准差（x-±s）表示，SPSS10.0软件分析。动态耐药模型磷酸化P38的检测行单因素方差分析；SB203580处理后计量资料行3×3析因设计方差分析，率的比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. 成功建立HepG2/CDDP耐药模型：成功建立能够维持在1.6mg/L的CDDP下长期培养的HepG2/CDDP耐药细胞株，记为HepG2/CDDP-1.6，细胞稳定传代，生长良好；采用MTT法检测HepG2细胞和HepG2/CDDP-1.6细胞体外药物敏感性，结果显示人肝癌细胞耐药模型HepG2/CDDP-1.6细胞对CDDP的IC50值为（3.47±0.06）mg/L，较对照HepG2细胞IC50［（0.51±0.01）mg/L］明显升高（t＝99.3, P<0.01），HepG2/CDDP-1.6细胞的耐药指数为6.8，系中度耐药，模型建立成功。

2. Western blot检测在HepG2/CDDP动态耐药细胞中P38的活化：在HepG2/CDDP动态耐药细胞中，24h、48h、72h、5d、7d时P-P38/P38的灰度比值分别为：0.39±0.02、0.45±0.03、0.52±0.02、0.63±0.04、0.77±0.04；磷酸化P38随着CDDP诱导培养时间的增加而逐渐增加（F＝69.39, P<0.01），见图1。

3. MTT检测各组细胞对顺铂的IC50值：不同处理组间差异具有统计学意义（F＝2934，P<0.01），其中SB203580组与对照组相比，IC50值降低（P< 0.01），DMSO组与对照组差异无统计学意义（P>0.05）。处理因素与时间因素间的交互效应具有统计学意义（F＝392，P<0.01）；随处理时间延长，对照组及DMSO组对顺铂的IC50值间差异无统计学意义（F值分别为1.13、0.46, P值均>0.05）而SB203580组对顺铂的IC50值逐渐降低（F＝2350, P<0.01），见表1。

4. 流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期：流式细胞仪检测各组细胞分别处理24、48、72h的不同时间点细胞周期的分布结果显示，随处理时间延长，SB203580组G1期细胞比例降低（χ2＝520，P<0.01），且在处理72h后，其G1期细胞较对照组显著下降（χ2＝2322，P<0.01），而72h后DMSO组与对照组相比，差异无统计学意义（χ2＝0.403，P>0.05）。见图2，表2。

5. Western Blot检测各组细胞Bcl-2、Bax及耐药分子P-gp的表达：不同处理组间Bcl-2/Bax表达比值、P-gp的表达差异均具有统计学意义（F值分别为358、190，P值均<0.01），其中SB203580组与对照组相比，其值均降低（P值均<0.01，），DMSO组与对照组差异均无统计学意义（P值均>0.05）。处理因素与时间因素间的交互效应均具有统计学意义（F值分别为149、77.2，P值均<0.01）；随着处理时间延长，对照组及DMSO组Bcl-2/Bax表达比值、P-gp的表达均逐渐升高（F值分别为204、61.2及256、69.1, P值均<0.01）而SB203580组细胞Bcl-2/Bax表达比值、P-gp的表达均逐渐降低（Ｆ值分别为83.8、107，P值均<0.01），见图3，表3。

讨    论

探索肿瘤细胞耐药的机制并加以有效逆转，已成为肿瘤研究及临床治疗急待解决的问题。既往体外建立耐药细胞系研究结果显示，当肿瘤细胞发生耐药时，常伴随有细胞倍增时间延长、增殖速度减慢，细胞周期阻滞，对化疗药物的敏感性降低[1]。耐药相关分子，如细胞膜转运蛋白P-gp表达升高[2]。肿瘤细胞还可通过抑制凋亡来实现自我保护[3-4]。如Bcl-2表达增加，bax表达下降等。

近来发现P38MAPK途径在消化系肿瘤发病、耐药、转移中起重要作用。P38MAPK激活时可阻滞细胞通过G1/S检验点，继而抑制细胞增殖。在胎肝、幼红细胞、小鼠胚胎成纤维细胞等中，P38下调JNK的磷酸化，进而降低转录因子C-JUN的活性，导致Cyclin D1与Cdc2的表达降低，使细胞停滞在G1期，抑制相应细胞的增殖[5]。在NIH313成纤维细胞内P38磷酸化也可下调细胞株中cyclin D1的表达使细胞阻滞于G1期[6]。

P38MAPK在部分细胞中可调节凋亡相关分子的表达而抑制细胞凋亡。在耐受紫外线照射的人角质化细胞中，P38的活化能增加RNA黏附分子对Bcl-X(L)的m-RNA 3′端非翻译区的黏附，抑制其降解，保护细胞逃避紫外线诱导的细胞凋亡[7]。而在硝硫氰酯诱导成骨细胞凋亡过程中，MAPK介导的NF-κB/AP-1激活可提高Bcl-X(L)的转录，对抗细胞凋亡[8]。

P38MAPK激活可能促进细胞耐药分子的表达。K562细胞耐药株中磷酸化P38升高，特异性抑制P38活性后，其P-gp表达被抑制，耐药性被逆转[9]。急性髓样白血病细胞在水银的压力下，P38信号途径被激活，进而提高MRP-1表达，利于细胞内水银的泵出[10]。Guo等[11]也发现，在耐长春新碱的人胃癌细胞系中，MDR1基因的表达增高，同时伴有P38及AP-1的活性增强，而特异性抑制P38后MDR1基因的表达下降，耐药细胞对化疗药物的敏感性也增强。

P38MAPK可调控TGFβ的自身诱导。在PTC细胞中，p38MAPK的激活对TGFβmRNA的转录后翻译必不可少，阻断p38MAPK后，虽然诱导TGFβ表达的转录因子及TGFβmRNA表达未明显改变，但TGFβ蛋白的生成明显减少[12]。相反，TGFβ亦可通过非Smads依赖途径调控p38 MAPK，TGFβ受体复合物可活化TRAF6，后者进一步活化TAK1并最终活化p38MAPK[13]。

本研究结果显示，随着CDDP诱导时间的延长，P38的磷酸化逐渐加强。进一步采用P38特异性阻断剂SB203580阻断HepG2/CDDP动态耐药模型内P38的活性研究结果提示，在HepG2细胞中，激活p38MAPK途径效应为抑制细胞增殖及凋亡，使细胞停滞在G1期，减少进入S期的细胞，同时促进耐药相关分子的表达，即加强HepG2细胞的耐药表型；而特异性抑制p38MAPK则逆转了HepG2细胞的耐药表型。

P38的活化加强HepG2细胞的耐药表型也可能与TGFβ/smads的信号通道相关。我们前期的研究结果显示，TGFβ/smads通路下游区的细胞生长周期抑制因子P15表达升高可促使HepG2耐药细胞停留在G1期[14]。TGFβ/smads通路也可通过促进P27的表达，使肿瘤细胞停留在G1期，其介导的细胞周期停滞可阻止细胞凋亡[15]。P38MAPK在HepG2耐药细胞中可能加强了TGFβ的自身诱导，通过上调TGFβ/smads通路,阻滞细胞增殖,使HepG2细胞停留在对顺铂不敏感的G1期，进而细胞得以增强保护性因子如Bcl-2、P-gp的表达，最终耐受顺铂。但p38MAPK在HepG2耐药细胞中是否通过TGFβ/smads信号通路引起耐药表型加强，其具体机制如何，仍需要进一步研究。

参  考  文  献

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（收稿日期：2010-03-22）

（本文编辑：金生）

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