| 首页 -> 基础研究 -> 小干扰RNA抑制核因子-κB活化对HepG2细胞凋亡的影响 小干扰RNA抑制核因子-κB活化对HepG2细胞凋亡的影响王以浪 姚登福 吴玮 赛文莉 邱历伟 杨君伶 朱建伟 【摘要】 目的 探讨小干扰RNA（siRNA）抑制核转录因子（NF）-κB活化对肝癌细胞凋亡的影响。 方法 化学合成NF-κB siRNA和阴性对照siRNA，脂质体法转染HepG2细胞，用巢式RT-PCR和荧光定量PCR检测NF-κB mRNA表达情况；免疫组织化学法、酶联免疫吸附法、Western blot检测NF-κB蛋白表达情况；用磷脂结合蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素法检测细胞凋亡，分析NF-κB表达抑制和细胞凋亡间关系。多个样本均数间的比较先行方差齐性检验，方差齐时行单因素方差分析；计数资料比较采用确切概率法分析。 结果 NF-κB p65 mRNA在HepG2细胞相对表达量为1.13±0.03，在正常肝细胞L02为0.29±0.07，两者比较，t＝27.02，P<0.05，差异有统计学意义。利用NF-κB siRNA干扰可下调NF-κB表达，且呈剂量、时间依赖；NF-κB siRNA转染HepG2细胞72h后，NF-κB mRNA和蛋白表达分别下降了93%和62%，抑制NF-κB表达使HepG2细胞凋亡增加85%。 结论 NF-κB在肝癌细胞中高表达，NF-κB siRNA能特异性抑制其在肝癌细胞中活化并促进癌细胞凋亡发生。 【关键词】 癌，肝细胞； NF-κB； 细胞凋亡； 小干扰RNA Effect of siRNA-mediated inhibition of nuclear transcription factor-kappa B on apoptosis of hepatocarcinoma cells WANG Yi-lang, Corresponding author: 【Abstract】 Objective To investigate the effect of siRNA-mediated inhibition of NF-κB on apoptosis of hepatocarcinoma cells. Methods Specific small interfering RNA Targeting NF-κB gene was synthesized and transfected into HepG2 cells by liposomes. Nested RT-PCR and quantitative RT-PCR were used to dectect the mRNA expression of NF-κB. Immunohistochemistry, enzyme-linked immunosorbent assay and Western blot were performed to examine the protein expression of NF-κB. Annexin V-FITC was used to test cell apoptosis. Results The expressin of NF-κB in HepG2 cells (1.13±0.03 ) was significantly higher (t = 27.02, P < 0.05) than that in normal hepatocytes (0.29±0.07). The down-regulation of NF-κB expression was depended on the dosage of siRNA and the time after transfection. 72 h after siRNA transfection, NF-κB expression reduced by 93% and 62% at the mRNA and protein levels, respectively. The apoptosis of HepG2 cells increased by 85% with NF-κB inhibition. Conclusions NF-κB is abnomally active in HepG2 cells and NF-κB inhibition mediated by siRNA promotes HepG2 cells apoptosis. It suggested that NF-κB could be a potential target for HCC prevention gene therapy. 【Key words】Carcinoma, hepatocellular; NF-kappa B; Apoptosis; Small interference RNA 核因子-κB（nuclear-transcription factor-κB, NF-κB）是一个具有广泛生物活性的转录因子，调控多种信号途径，作为细胞内信号传递的一个枢纽介导了多种生理过程的调控，其表达的异常会导致机体的多种病理学改变[1]。NF-κB在炎症与肝细胞癌（HCC）形成中起了桥梁作用[2-3]，是调控癌细胞凋亡的主要因子，能调节肿瘤的血管生成与侵袭能力[4]。前期研究结果显示NF-κB在人HCC组织中过表达[5]，但NF-κB在HCC形成中的凋亡抑制机制尚有待进一步研究。现以NF-κB小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）特异性抑制HepG2细胞NF-κB表达，观察NF-κB抑制效果及对HepG2细胞凋亡的影响，探讨NF-κB信号通路与HCC细胞凋亡的关系。 材料与方法 一、细胞株和实验分组 人肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞L02购自南京凯基生物科技发展有限公司。实验分正常对照（Con）组、脂质体（Lip）组、阴性siRNA对照（Neg）组、p65 siRNA转染组和siRNA转染组，设5个浓度梯度：100、50、10、1.0nmol/L和0.1nmol/L。 二、主要试剂与仪器 RPMI 1640和胎牛血清购自美国Gibco公司，脂质体Lipo-fectamineTM2000购自美国Invitrongen公司，RNA抽提试剂购自美国Molecular Research Cente公司，第一链cDNA合成试剂盒购自以色列Fermentas公司，RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，NF-κB p65荧光定量PCR标准品由上海闪晶分子生物技术研究所构建合成，NF-κB p65酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒购自美国Cusabio Biotech公司，兔抗人NF-κB p65单克隆抗体和磷脂结合蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，定量PCR扩增仪、凝胶成像分析仪和核酸蛋白分析仪购自美国Bio-Rad公司。 三、方法 1. RT-PCR和荧光定量PCR：检测p65 siRNA转染后HepG2细胞NF-κB mRNA表达：细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中生长到融合度达50%～60%时，Lip组按转染试剂说明书加入脂质体，Neg组加入终浓度100nmol/L的阴性siRNA和脂质体，p65 siRNA转染组加入不同终浓度的p65 siRNA和脂质体，siRNA（表略）由百奥生物技术有限公司合成。于不同时间点取细胞按说明书抽提RNA，纯化并测定RNA含量。以特异性引物（表略）进行RT-PCR，并取RT-PCR内部引物行定量PCR，引物由上海英骏生物公司合成。 逆转录按试剂说明书操作。PCR反应体系：0.1μg cDNA，上下游引物各10nmol，Premix Taq 12.5μl，加双蒸水至25μl。扩增条件：94℃ 5min，94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1min，30个循环；72℃延伸10min。取产物5μl 在15g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪采集图像。荧光定量 PCR反应体系：0.1μg cDNA；上下游引物各10nmol；Premix Taq 12.5μl，加双蒸水至25μl。扩增条件：94℃ 4min，94℃ 30s、60℃ 1min，30个循环。用icycler定量PCR扩增仪软件分析扩增产物拷贝数。 2. ELISA法定量分析NF-κB p65 siRNA 转染后HepG2细胞p65核蛋白表达：按核蛋白抽提试剂盒说明书进行操作，得到总核蛋白并测定其浓度。ELISA操作按说明书进行，用酶标仪在450nm波长测量核蛋白吸光度。绘制标准曲线，计算p65核蛋白浓度。 3. Western blot分析NF-κB p65 siRNA 转染后HepG2细胞p65总蛋白表达：细胞分组和转染同RT-PCR，按核蛋白抽提试剂盒说明书提取总蛋白并测定浓度。制作10%分离胶和4%浓缩胶，取蛋白样品20μg点样。电泳条件：80V 35min，100V 60min。转膜条件：300mA 110min。封闭，加兔抗人NF-κB p65第一抗体（1∶500稀释），4℃过夜，加羊抗兔IgG第二抗体（1∶5000稀释），室温孵育2h，漂洗、显影并摄像。 4. 免疫组织化学分析：NF-κB p65 siRNA转染后HepG2细胞NF-κBp65表达：细胞分组和转染同前，72h取出盖玻片以4%中性甲醛液固定细胞，免疫组织化学检测采用链霉菌抗生物素-过氧化物酶法。细胞中呈现棕黄色颗粒为NF-κB p65表达阳性，每个样本随机取5个视野计算每视野细胞NF-κB p65阳性率（阳性细胞/总细胞×100%），取5个视野阳性表达平均数为样本NF-κB p65阳性表达率。 5. 细胞凋亡检测：应用磷脂结合蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素法行细胞凋亡检测，按凋亡检测试剂盒说明书操作，用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。 四、统计学处理 计量资料以均数±标准差（x-±s）表示，多个样本均数间的比较先行方差齐性检验，方差齐时行单因素方差分析；计数资料比较采用确切概率法分析。以Stata10.0统计软件处理、分析数据，P<0.05为差异有统计学意义。 结 果 一、NF-κB p65在L02和HepG2细胞中表达 RT-PCR产物进行凝胶电泳分析，见HepG2细胞中NF-κB p65 mRNA表达明显比L02细胞高（图略）。NF-κB p65 mRNA吸光度相对值（NF-κB p65/GAPDH）在L02细胞为0.29±0.07，HepG2细胞为1.13±0.03, 两种细胞NF-κB p65 mRNA的表达比较，t＝27.02，P<0.05，差异有统计学意义。 二、NF-κB p65 siRNA转染后NF-κB p65 mRNA表达 NF-κB p65 siRNA转染组细胞NF-κB p65基因RT-PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，见转染组细胞中NF-κB p65 mRNA表达明显比Con组低，且随NF-κB siRNA浓度增加或转染时间延长而降低（图略）。 用荧光定量PCR对NF-κB p65基因扩增进行定量分析，Con组、Lip组和Neg组中p65基因扩增拷贝量无明显差异。观察不同浓度NF-κB p65 siRNA对p65表达影响，发现NF-κB siRNA转染各组（除0.1nmol/L组）72h后NF-κB p65基因扩增拷贝量明显低于空白组,t值分别为28.98、27.26、24.47和11.92，P值均<0.01，差异均有统计学意义,且随siRNA浓度增高而降低（图略），但100nmol/L和50nmol/L转染组差异无统计学意义。观察转染后不同时间NF-κB p65 siRNA对p65表达影响，随着转染时间延长，NF-κB p65基因拷贝量逐渐下降，转染72h后和空白组相比，100nmol/L组NF-κB p65 mRNA表达水平下降了93%（图略）。 三、NF-κB p65 siRNA抑制HepG2细胞NF-κB p65蛋白表达 1. NF-κB siRNA转染后NF-κB p65蛋白胞内定位：NF-κB p65阳性染色为棕黄色，镜下观察空白组细胞中NF-κB p65阳性表达在细胞质和细胞核中均有分布；NF-κB siRNA转染组中NF-κB p65阳性表达细胞明显减少，且主要分布于细胞质中，见图3。对NF-κB p65阳性染色细胞定量分析显示空白组细胞中NF-κB p65阳性细胞率为63%；NF-κB siRNA转染组细胞中NF-κB p65阳性细胞率为9%，两组比较，t＝25.94，P<0.01，差异有统计学意义。 2. NF-κB siRNA转染后NF-κB p65蛋白分析：Western blot分析显示Con组、Lip组和Neg组细胞中NF-κB p65蛋白表达水平无明显差别；转染组细胞中NF-κB p65蛋白条带灰度较空白组明显降低，且随siRNA浓度增加而降低（图略）。 3. NF-κB p65 siRNA转染后NF-κB p65核蛋白：Con组、Lip组和Neg组细胞核中NF-κB p65蛋白浓度无明显差别；转染组细胞核中NF-κB p65蛋白量（除0.1nmol/L组外）比Con组明显降低，t值分别为24.76、23.55、18.07和8.18，P值均<0.01，差异均有统计学意义。其中最高浓度100nmol/L组NF-κB p65表达下降62%；且转染组细胞核中NF-κB p65蛋白随siRNA浓度升高而降低（图略）。 4. NF-κB p65 siRNA促进HepG2细胞凋亡： 转染72h后凋亡检测显示，Lip组细胞凋亡率为4.63±0.38，Con组为4.25±0.79，两组比较，差异无统计学意义（P>0.05），转染各组细胞凋亡率均比空白组高，其中100nmol/L组细胞凋亡率最高为7.86±0.41，与Con组相比增加了85%，两组比较，t＝9.93，P<0.01，差异有统计学意义。除最高浓度组外，其余各转染组与空白组的差异均无统计学意义（P值均>0.05）。 讨 论 HCC发生和发展具有多病因、多中心和多阶段特征[6]。HCC不仅是一种增殖失控的疾病，而且也是一种细胞凋亡异常的疾病[7]。NF-κB主要存在于胞质中，有p65、RelB、C-Rel、p50和p52五个亚基，亚基间可形成同源或异源二聚体，其中p50/p65二聚体最常见，生物学作用也最广泛。静止期时二聚体与NF-κB抑制蛋白家族成员结合，形成无活性的三聚体。当受到细胞因子、有丝分裂原、病毒等刺激后，NF-κB抑制蛋白α通过磷酸化、泛素化而降解，使NF-κB的核定位信号暴露，NF-κB进入到细胞核内，与靶基因的κB位点结合，从而发挥其转录调节作用[7]。 细胞增殖与凋亡之间的动态平衡是维持机体稳态的重要方式，一旦平衡被打破，细胞增殖失控，肿瘤就可能发生。NF-κB是一种广泛存在于真核细胞中的转录因子，作为多种信号转导途径的汇聚点，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖和转化。肝炎病毒持续感染、肝脏慢性炎症以及特定细胞因子异常活化致使NF-κB过表达，在HCC的发生、发展及进展中扮演了重要角色。研究扩增正常肝细胞和肝癌细胞中NF-κB亚单位p65基因表达发现p65基因在肝癌细胞中显著高表达，这和前期研究人HCC标本显示HCC组织中NF-κB相对其癌旁组织显著高表达是一致的，推测NF-κB过表达与HCC形成相关。 用RNA干扰技术特异性抑制p65表达，PCR扩增结果显示p65 siRNA显著抑制HepG2细胞p65 mRNA表达，表明RNA干扰是一个有效的基因沉默手段。转染p65 siRNA后HepG2细胞中p65总蛋白表达明显被抑制。由于NF-κB进入到核内才能发挥转录调节作用，进一步分析发现p65核蛋白亦被显著抑制。免疫组织化学分析显示NF-κB在HepG2细胞中高表达，且主要分布在细胞核内，p65 siRNA转染后NF-κB表达无论在细胞质和细胞核中均显著降低，表明p65 siRNA可以有效下调胞核中NF-κB表达进而抑制其转录调节作用。 NF-κB抗凋亡作用可能是促进肿瘤形成原因之一。NF-κB可上调细胞凋亡功能元件，包括Bcl-2家族、细胞凋亡抑制蛋白家族、Fas相关死亡区域蛋白样白细胞介素1F转化酶抑制蛋白及肿瘤坏死因子受体相关因子家族等[8-9]。本研究分析siRNA抑制p65表达对HepG2细胞凋亡的影响，结果显示NF-κB抑制后细胞凋亡增加了约一倍。由此可见，下调NF-κB表达可以促进肝癌细胞凋亡，但涉及哪些NF-κB下游凋亡基因尚有待于进一步研究。本研究结果提示NF-κB过表达与HCC密切相关，用RNAi技术可以有效抑制肝癌细胞NF-κB表达并促进其凋亡，表明NF-κB是HCC基因治疗的理想靶点。 参 考 文 献 [1]Li Q, Withoff S, Verma IM. 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