| 首页 -> 基础研究 -> 胶原和生长因子对大鼠肝星状细胞迁移及细胞骨架的影响 胶原和生长因子对大鼠肝星状细胞迁移及细胞骨架的影响李蕾 蒋炜 王吉耀 杨长青 【摘要】 目的 观察胶原、生长因子刺激后肝星状细胞迁移变化，并观察生长因子刺激后细胞骨架的变化。 方法 分离原代大鼠肝星状细胞，用Transwell小室观察Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、血小板衍生生长因子-BB、转化生长因子β1直接及趋化刺激后细胞迁移改变，并按不同处理方式分为对照组、转化生长因子β1趋化刺激组、PDGF-BB趋化刺激组、Ⅰ型胶原趋化刺激组、Ⅳ型胶原趋化刺激组、转化生长因子β1直接刺激组、PDGF-BB直接刺激组、Ⅰ型胶原直接刺激组、Ⅳ型胶原直接刺激组。异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白，共聚焦激光扫描显微镜观察血小板衍生生长因子-BB、转化生长因子β1刺激后细胞骨架的变化。多组样本均数间差异比较用单因素方差分析。 结果 对照组迁移细胞数为每高倍视野（102.93±1.01）个，转化生长因子β1趋化刺激组及直接刺激组迁移的细胞数分别为每高倍视野（210.17±1.78）个、（131.37±3.15）个，与对照组相比，F值分别为40.84，64.53，P值均<0.05，差异均有统计学意义；PDGF-BB趋化刺激组及直接刺激组迁移细胞数为每高倍视野（319.56±11.71）个、（203.67±7.54）个，与对照组相比，F值分别为40.90、54.57，P值均<0.05，差异均有统计学意义；Ⅰ型胶原趋化刺激组及直接刺激组迁移细胞数为每高倍视野（201.52±11.28）个、（127.20±6.47）个，与对照组相比，F值分别为41.01、36.49，P值均<0.05，差异均有统计学意义；Ⅳ型胶原趋化刺激组及直接刺激组迁移细胞数为每高倍视野（108.14±4.35）个、（108.60±4.10）个，与对照组相比，F值分别为4.94、5.42，P值均>0.05，差异均无统计学意义。血小板衍生生长因子-BB及转化生长因子β1刺激后细胞形态改变，随时间不同出现层状伪足、丝状伪足及应力纤维的改变。 结论 Ⅰ型胶原、血小板衍生生长因子-BB、转化生长因子β1可促进肝星状细胞迁移，血小板衍生生长因子-BB、转化生长因子β1刺激后肝星状细胞的细胞骨架改变。 【关键词】 转化生长因子β； 胶原； 迁移，细胞； 细胞骨架 Effect of collagens and growth factors (TGFβ1, PDGF-BB) on cytoskeletal reorganization and cell migration in hepatic stellate cells LI Lei, JIANG Wei, WANG Ji-yao, YANG Chang-qing. Department of Gastroenterology, Corresponding author: JIANG Wei, Email: jiang.wei@ zs-hospital.sh.cn 【Abstract】 Objective To eavaluate the effects of collagens and growth factors TGFβ1 and PDGF-BB on the cytoskeletal components and migration in cultured rat hepatic stellate cells (HSCs). Methods Primary rat hepatic stellate cells were isolated and cultured. A Transwell Chamber system was used to observe the changes of serum starved HSCs haptotactic migration (direct stimulation) and chemotactic migration (indirect stimulation) after collagens and growth factors treatment. Changes in actin cytoskeletal organization were visualized by fluorescence staining using FITC-labeled phalloidin and the fluorescence images were recorded using confocal microscopy. Results TGFβ1 enhanced significantly the motility of primary HSCs at 5 ng/ml: for haptotactic migration cells: 131.37±3.15 vs 102.93±1.01, F = 40.84, P < 0.05; for chemotactic migration cells: 210.17±1.78 vs 102.93±1.01, F = 64.53, P < 0.05. PDGF-BB enhanced significantly the motility of primary HSCs at 10 ng/ml (haptotactic migration cells: 203.67±7.54 vs 102.93±1.01, F = 40.90, P < 0.05; chemotactic migration cells: 319.56±11.71 vs 102.93±1.01, F = 54.57, P < 0.05); Both chemotatic and haptotactic stimuli with 100μg/ml collagen typeⅠsignificantly increased HSCs migration: for haptotactic migration cells: 127.20±6.47 VS 102.93±1.01, F = 41.01, P < 0.05; for chemotactic migration cells: 201.52±11.28 vs 102.93±1.01, F = 36.49, P < 0.05; however, collagen type IV had no effect on HSCs migration. Serum-starved, untreated cells had a rounded-up morphology. PDGF-BB and TGFβ1 induced a rapid morphological change concomitant with a robust reorganization of actin cytoskeleton in HSCs. Conclusions Collagen type I, PDGF-BB and TGFβ1 could induce cell migration in HSCs, but collagen type IV has no such effect. PDGF-BB and TGFβ1 could induce the actin cytoskeleton reorganization in HSCs. 【Key words】Transforming growth factor beta; Collagen; Migration, cell; Cytoskeleton 本研究探讨Ⅰ、Ⅳ型胶原、血小板衍生生长因子 (platelet-derived growth factor，PDGF) -BB、转化生长因子（TGF）β1对大鼠肝星状细胞（HSC）迁移及肌动蛋白细胞骨架的影响。 材料与方法 1.动物与主要试剂：雄性SD大鼠，体质量400～450g，购自中国科学院上海实验动物中心，Ⅳ型胶原酶、链酶蛋白酶、DNA酶Ⅰ、密度梯度分离液、异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原均购自美国Sigma公司，Transwell小室、DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、TRIzol均购自美国Gibco公司，重组人PDGF-BB、TGFβ1均购自美国PeproTech公司。 2．HSC分离和培养：采用胶原酶二步原位灌注密度梯度离心法分离大鼠HSC，DMEM重新悬浮，经结蛋白免疫细胞化学染色与光镜下典型胞内脂肪滴形态学鉴定，细胞浓度90%～93％，锥虫蓝染色判定细胞活力大于90%。调整细胞浓度为1×106个/ml，接种于含20%胎牛血清的DMEM高糖培养基的塑料培养皿中，37℃，5% CO2培养箱培养。24h半保留换液，培养7d，中间换液1次。每项实验所用细胞取自同一大鼠，重复3次。 3. 改良微孔滤膜培养小室构建：Transwell小室上下腔之间置入PVPF聚碳酸酯膜，其上层面涂布50μg/ml Ⅳ型胶原，下层面涂布50μg/mlⅠ型胶原，上腔模拟正常肝组织中内皮细胞与肝细胞间的Disse间隙微环境，加入大鼠HSC；下腔模拟肝脏炎症时微环境，充满DMEM[1]。 4. 细胞迁移实验：同代细胞培养至对数生长期接近70%融合时，用无血清DMEM高糖培养液洗涤细胞2次，再用含0.5%胎牛血清的DMEM培养液同步培养24h。0.25%胰蛋白酶消化，用无血清培养液制备成单细胞悬液，计数。改良的微孔膜培养小室上腔分别加入2×104个细胞，并分为对照组：培养小室下腔加入600μl无血清DMEM；TGFβ1趋化刺激组：培养小室下腔加入600μl无血清DMEM加TGFβ1至5ng/ml；PDGF-BB趋化刺激组：培养小室下腔加入600μl无血清DMEM加PDGF-BB至10ng/ml；Ⅰ型胶原趋化刺激组：培养小室下腔加入600μl无血清DMEM加Ⅰ型胶原至100μg/ml；Ⅳ型胶原趋化刺激组：培养小室下腔加入600μl无血清DMEM加Ⅳ型胶原至100μg/ml；TGFβ1直接刺激组：培养小室上腔加入TGFβ1至 5ng/ml，下腔加入600μl无血清DMEM；PDGF-BB直接刺激组：培养小室上腔加入PDGF-BB至10ng/ml，下腔加入600μl无血清DMEM；Ⅰ型胶原直接刺激组：培养小室上腔加入Ⅰ型胶原至100μg/ml，下腔加入600μl无血清DMEM；Ⅳ型胶原直接刺激组：培养小室上腔加入Ⅳ型胶原至100μg/ml，下腔加入600μl无血清DMEM；各组均在37℃，5% CO2培养箱培养4h后吸去上腔残留细胞，并用湿棉球轻擦去未迁移的细胞，已迁移细胞用3.7%多聚甲醛固定、苏木素染色，相差显微镜下随机计数5个视野的细胞数，取平均值。 5．免疫荧光化学检测：同代细胞培养至对数生长期接近70%融合时，用无血清DMEM高糖培养液洗涤细胞2次，0.25%胰蛋白酶消化，再用含0.5%胎牛血清的DMEM培养液同步培养于盖玻片上24h，经TGFβ1 5ng/ml、PDGF-BB 10ng/ml分别处理后，用冰磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3遍，4%多聚甲醛室温固定20min，体积分数0.5% Triton X-100透化处理20min，加入5ng/ml异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽80μl，37℃避光孵育40min，以上每一步骤后均用PBS冲洗3遍，最后用10%的缓冲甘油封片置于共聚焦激光扫描显微镜（1024ES型，购自美国Bio-Rad公司）下观察。 6. 统计学处理：所有数据用SPSS11.5统计软件分析，实验结果用均数±标准差（x-±s）表示。多组样本均数间差异比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。 结 果 1. 细胞迁移改变：对照组迁移细胞数为每高倍视野（102.93±1.01）个，TGFβ1趋化刺激组及直接刺激组迁移的细胞数分别为每高倍视野（210.17±1.78）个、（131.37±3.15）个，与对照组相比，F值分别为40.84、64.53，P值均<0.05，差异均有统计学意义；PDGF-BB趋化刺激组及直接刺激组迁移细胞数为每高倍视野（319.56±11.71）个、（203.67±7.54）个，与对照组相比，F值分别为40.90、54.57，P值均<0.05，差异均有统计学意义；Ⅰ型胶原趋化刺激组及直接刺激组迁移细胞数为每高倍视野（201.52±11.28）、（127.20±6.47）个，与对照组相比，F值分别为41.01、36.49，P值均<0.05，差异均有统计学意义；Ⅳ型胶原趋化刺激组及直接刺激组迁移细胞数为每高倍视野（108.14±4.35）个、（108.60±4.10）个，与对照组相比，F值分别为4.94、5.42，P值均>0.05，差异均无统计学意义。 2. TGFβ1、PDGF-BB诱导后大鼠HSC细胞骨架构建状况：对照组显示大鼠HSC呈椭圆形，体积较小，有长的突起，细丝状肌动蛋白主要分布在细胞周边及长突起处，胞内未见明显的丝状伪足、板状伪足以及应力纤维。 TGFβ1刺激后细胞呈快速的形态改变，表现为细胞伸展，体积增大，刺激5min后可见丝状伪足形成，15min后仍可见丝状伪足，应力纤维形成，30min时丝状伪足较前减少，细胞周围少量板状伪足形成，应力纤维较前增加，并见黏着斑位于细胞周边板状伪足处，应力纤维附着于黏着斑，见图1。PDGF-BB诱导5min后出现板状伪足，15min时出现应力纤维及少量丝状伪足，30min时应力纤维及丝状伪足较前增加，并见细胞周边黏着斑，见图2。 讨 论 在炎症状态下，HSC活化后细胞形态及代谢情况可发生显著改变，转化为肌成纤维母细胞，产生大量细胞外基质[2]；活化的HSC尚能表现出迁移的特性[1]，而细胞形态改变、细胞迁移依赖于持续的细胞骨架的重建[3]。 为明确细胞因子、胶原对活化的HSC迁移功能的影响，我们采用改良的Transwell小室双腔系统，在中间层上层预铺Ⅳ型胶原，模拟Disse间隙的基底膜层，下层预铺Ⅰ型胶原，模拟Disse间隙的间质层，通过在上腔或下腔置入Ⅰ型胶原或Ⅳ型胶原，模拟正常和肝损伤时Disse间隙内细胞外基质成分的变化。Transwell小室上下腔之间的聚碳酸酯膜上直径8μm的微孔可允许HSC细胞穿过到达膜的下面，这些穿越迁移的HSC细胞可黏附于膜的下面，通过计数滤膜下面的细胞可基本反映细胞的迁移情况。 肝纤维化时多种细胞因子通过自分泌与旁分泌发挥作用，其中最重要的为TGFβ1与PDGF-BB。TGFβ1是目前已知的重要致肝纤维化的细胞因子之一[4]，在肝纤维化的起始和持续发展中起关键作用[5]。本研究结果显示，不同浓度的TGFβ1、PDGF-BB、Ⅰ型胶原均可引起HSC细胞迁移增加，并随浓度增加，迁移细胞亦增加，而各浓度Ⅳ型胶原对HSC迁移均无明显影响。研究结果显示TGFβ1的直接及趋化刺激均可增加HSC迁移，与对照组相比差异均有统计学意义，提示TGFβ1可促进HSC迁移，可视为其促进肝纤维化的另一机制。PDGF是目前已知多肽生长因子中对HSC作用最强的有丝分裂原, 已知PDGF与受体结合后可经Ras激活局部黏附激酶酪氨酸磷酸化,从而促HSC增殖、趋化。本研究证实其直接及趋化刺激均可增加HSC迁移，与对照组相比，差异均有统计学意义，由PDGF促进HSC增殖作用明显，考虑其刺激后HSC迁移增加部分是由于增殖增加所致。Yang等[1]对PDGF-BB刺激后HSC进行增殖分析，证实HSC迁移增加部分由HSC增殖所致，而TGFβ1刺激后HSC迁移增加无增殖影响。 正常Disse间隙由基底膜样基质构成，主要为Ⅳ、Ⅵ型胶原，允许一些分子通过内皮细胞窦间孔到达肝细胞，并提供肝实质的结构完整性。在正常状态下，肝内细胞外基质作为细胞的支架，不是处于一种静止状态，尽管转换水平较低，但它仍是各成分按一定比例合成的新陈代谢动态平衡过程[6]。肝纤维化时，这种平衡被打破，细胞外基质的合成超过其降解，在肝内沉积过多,并出现各构成成分比例的变化, 由基底膜样基质转化为富含形成纤维的基质如Ⅰ、Ⅲ型胶原及纤维连接素[7]。细胞外基质在肝纤维化发生和发展过程中不只是被动沉积，它还主动参与基质-细胞相互作用，通过影响细胞的形态、发育、移动、增殖以及细胞的功能，在维持组织的结构、发育增殖等方面起着重要作用[8],促进肝纤维化发展。 本研究证实100μg/ml Ⅰ型胶原的趋化及直接刺激均可使HSC迁移增加，与对照组差异有统计学意义；而Ⅳ型胶原趋化及直接刺激对HSC迁移无明显影响。可见肝纤维化时细胞外基质成分的改变不仅可促进HSC活化、增殖，也可促进活化的HSC的迁移，呈“正反馈”调节加速肝纤维化进程。 HSC活化的标志是细胞由圆形伸展变形为星芒状的肌成纤维细胞，而细胞迁移由四个机械分离的步骤组成：层状伪足的伸出、新黏附的形成、细胞体收缩及尾部脱黏附。与静止HSC活化时细胞形态改变一样，细胞迁移亦伴随着细胞骨架的改变,而细胞骨架已被认为是细胞因子等细胞外信号启动及调节细胞内信号转导时首要的靶蛋白[9]。肌动蛋白是细胞骨架的重要组成部分，多个肌动蛋白单体组成束状的肌动蛋白丝聚集形成应力纤维。基于鬼笔环肽能高度特异性的与肌动蛋白单体结合的特点，我们用荧光素标记的鬼笔环肽检测TGFβ1、PDGF-BB刺激后细胞骨架的改变，发现TGFβ1、PDGF-BB刺激后HSC有快速的细胞形态改变，表现为细胞伸展，并有层状伪足、丝状伪足、应力纤维形成，这与已知的HSC活化时细胞表型转变相适应，并可为迁移时细胞特征性的形态改变。 参 考 文 献 [1]Yang C, Zeisberg M, Mosterman B, et al. Liver fibrosis: insights into migration of hepatic stellate cells in response to extracellular matrix and growth factors. Gastroenterology, 2003, 124: 147-159. [2]Friedman SL. Mechanisms of hepatic fibrogenesis. Gastroenterology, 2008, 134:1655-1669. [3]Tufvesson E, Westergren-Thorsson G. Biglycan and decorin induce morphological and cytoskeletal changes involving signalling by the small GTPases RhoA and Rac1 resulting in lung fibroblast migration. J Cell Sci, 2003, 116(Pt 23): 4857-4864. [4]Gressner AM , Weiskirchen R , Breitkopf K, et al. Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis. Front Biosci, 2002, 7: d793-807. [5]Kaimori A, Potter J, Kaimori JY, et al. Transforming growth factor-beta1 induces an epithelial-to-mesenchymal transition state in mouse hepatocytes in vitro. J Biol Chem, 2007, 282: 22089-22101. [6]Roderfeld M, Geier A, Dietrich CG, et al. Cytokine blockade inhibits hepatic tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression and up- regulates matrix metalloproteinase- 9 in toxic liver injury. Liver Int, 2006, 26: 579-586. [7] [8]Benyon RC, Arthur MJ. Extracellular matrix degradation and the role of hepatic stellate cells. Semin Liver Dis, 2001, 21: 373 - 384. [9]Le Clainche C, Carlier MF. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev, 2008, 88: 489-513. （收稿日期：2009-11-21） （本文编辑：孙宇航） 中华医学会肝脏病杂志版权 |