细胞色素酶P4502E1介导的氧化应激对人肝星状细胞的活化作用

【摘要】  目的  研究细胞色素酶P4502E1（CYP2E1）介导的氧化应激对人肝星状细胞的活化作用。 方法  以CYP2E1为目的基因，将CYP2E1表达载体PCI-CYP2E1及空载体PCI-neo转染到人肝癌细胞株HepG2细胞，分别为HepG2/CYP2E1，HepG2/PCI。检测HepG2/CYP2E1，HepG2/PCI及正常HepG23组细胞上清液中丙二醛（MDA）含量。将上述3种细胞分别与人肝星状细胞LX2共培养48h，分别命名为CYP2E1/LX2组，PCI/LX2组，HepG2/LX2组，提取RNA、上清液，用羟脯氨酸（Hyp）试剂盒检测3组LX2上清液中Hyp含量，用逆转录多聚酶链反应检测LX2细胞内Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶2（MMP2）的mRNA水平，用酶联免疫吸附试验检测3组上清液中LX2分泌的Ⅰ型前胶原羧基肽（PICP）蛋白水平，用明胶酶谱法检测3组上清液中LX2分泌的MMP2酶活性。组间比较用单因素方差分析进行统计学分析。 结果  （1）HepG2/CYP2E1细胞、阴性对照组HepG2细胞及HepG2/PCI细胞的MDA值分别为（6.51±0.25）nmol/ml、（3.07±0.29）nmol/ml和（2.57±0.29）nmol/ml，F值为22.66，P值均<0.01。（2）HepG2/CYP2E1、HepG2、HepG2/PCI 3组细胞培养液中Hyp含量分别为（35.24±3.52）nmol/ml、（24.50±1.37）nmol/ml和（17.77±2.58）nmol/ml，F值为58.89，P值均<0.01；3组LX2细胞I型胶原mRNA水平表达，差异无统计学意义。CYP2E1/LX2组、阴性对照组HepG2组及PCI/LX2组LX2分泌的PICP蛋白吸光度值分别为540.01±11.38、262.57±15.61和231.59±12.76，F值为124.97，P值均<0.01；3组LX2细胞内MMP2 mRNA水平表达、MMP2的酶活性，差异无统计学意义。 结论  CYP2E1可引起氧化应激，CYP2E可增加LX2细胞外Hyp的合成和分泌。CYP2E1活化了肝星状细胞，可促进其细胞外PICP合成与分泌。

【关键词】  肝硬化;  细胞色素P450 CYP2E1； 氧化性应激； 肝星状细胞

Stimulation of human hepatic stellate cells by cytochrome P4502E1-mediated oxidative stress    LI Jing*, LIU Tian-hui, YOU Hong, XU You-qing, WANG Chen. *Department of Internal Medicine, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China

Corresponging author: XU You-qing, Email: youqingxu@ hotmail.com

Co-corresponging author: WANG Chen, Email: wangchen-tr2002@ 163.com 

【Abstract】 Objective    To explore the stimulation of human hepatic stellate cells by Cytochrome P4502E1-mediated oxidative stress. Methods    HepG2-line was transfected with hunman CYP2E1 plasmid  (HepG2/CYP2E1) and empty plasmid (HepG2/PCI) respectively. The CYP2E1 expression was evaluated with RT-PCR and Western blot. MDA was measured in culture medium of HepG2 cell lines. LX2 was co-incubatied with HepG2/CYP2E1, HepG2/PCI and HepG2 respectively. The level of hydroxyproline in culture medium was examined in 48 hours and the cells were lysated and total RNA and protein were extracted. COL-1 and MMP2 mRNA levels were detected by RT-PCR and analyzed semi-quantitatively. PICP proteins were measured by ELISA. Zymography was performed to investigate MMP2 enzymatic activities. Results     (1) MDA from the HepG2 which (HepG2/CYP2E1)express human CYP2E1 (6.51±0.25) was significantly higher than that from the HepG2 which do not (HepG2/PCI)express human CYP2E1 (3.07±0.29)and HepG2 alone (2.57±0.29). (F = 22.66, all P < 0.01). (2) After co-incubatied for 48 hours,the level of hydroxyproline in culture medium (35.24±3.52) excreted from CYP2E1/LX2 could significantly increase (F = 58.89, P < 0.01). PICP protein (540.01±11.38) excreted from CYP2E1/LX2 was significantly increased (F = 124.97, P < 0.01). Zymography showed MMP2 gene expression and enzymatic activities of MMP2 had no difference among the groups (F = 0.29, P > 0.05) (F = 0.33, P > 0.05). Conclusions    CYP2E1 derived oxidative stress mediated stimulation of collagen I synthesis by hepatic stellate cells. Hydroxyproline excreted by LX2 was increased by CYP2E1. COL-1mRNA had no difference among the groups (F = 0.73, P > 0.05).

【Key words】Liver cirrhosis; Cytochrome P450 CYP2E1; Oxidative stress; Hepatic stellate cells

本实验观察细胞色素P4502E1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）对HepG2细胞合成脂质过氧化产物丙二醛（malondialdehyde，MDA）的影响，将稳定表达CYP2E1的HepG2细胞与人肝星状细胞（HSC）系LX2共培养，观察细胞之间的相互作用，CYP2E1对LX2合成和表达Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶2（metalloproteinases2，MMP2）等的影响，以期进一步探讨CYP2E1在肝纤维化的分子机制方面的作用。

材料与方法

1. 实验材料：HepG2细胞、LX2细胞均为北京友谊医院提供。含有人类完整的CYP2E1目的基因产物为美国纽约大学西奈山医学院酒精性肝病实验室惠赠，MDA测定试剂盒、羟脯氨酸（hydroxylysine，Hyp）测定试盒均购自南京建成生物工程研究所。插入式细胞培养皿Millicell购自茂健联星科技有限公司。总RNA提取试剂盒、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、寡聚胸腺嘧啶引物、琼脂糖均购自美国Promega公司。Taq酶、PCR分子量标准购自天为时代公司。人Ⅰ型胶原前胶原定量酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒购自日本TaKaRa公司。CYP2E1第一抗体为兔抗大鼠IgG多克隆抗体（ab53945），购自美国ABcam公司。第二抗体为zb-2301辣根过氧化物酶标记羊抗兔多克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。化学发光液购自美国Pierce公司。FuGENE瓾D转染试剂盒, 购自德国罗氏公司。PICP ELISA试剂盒（编号MK101）购自日本TaKaRa公司。

2. 稳定表达CYP2E1的肝癌细胞系的建立：将含有人类完整的CYP2E1目的基因产物，通过用传统分子克隆重组技术插入PCI-neo质粒载体，构建出含人类CYP2E1完整基因的质粒PCI-CYP2E1。取正常HepG2细胞(北京友谊医院提供)。分为空白对照（HepG2）组：正常HepG2细胞；HepG2/CYP2E1组：转染CYP2E1质粒的HepG2细胞；HepG2/PCI组：转染空质粒的HepG2细胞。利用PCI-neo质粒载体的neo基因在加G418培养条件下对各组细胞进行筛选[1]。

3. RT-PCR鉴定CYP2E1表达：提取总RNA，进行逆转录。设计CYP2E1引物如下：上游5′-TCATAGCCGACATCCTCTTC-3′，下游：5′-GTTGTGCTGGTGGTCTCTGT-3′。PCR扩增片段长度为367bp。PCR条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，共40个循环。以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照计算比值。

4. Western blot鉴定CYP2E1蛋白表达：待细胞长至90%融合时，胰酶消化收集细胞, 蛋白裂解液处理并制备蛋白样品, 将蛋白样品行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用湿转方法转移到硝酸纤维素膜上, 膜以封闭液室温振荡封闭2h,加入以封闭液稀释的第一抗体（l∶2500）4℃冰箱过夜, 吐温-三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲盐溶液洗涤，每次10min, l∶2000稀释的第二抗体于室温孵育2h, 吐温-三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲盐溶液洗涤，每次10min，加发光液进行化学发光显影。

5. 检测HepG2，HepG2/CYP2E1，HepG2/PCI 3组细胞培养液中MDA含量：分别取HepG2，HepG2/CYP2E1，HepG2/PCI 3组细胞的细胞培养液，参照南京建成生物研究所提供的MDA测定试剂盒的操作步骤进行。分别测定3组细胞培养液中MDA含量。

6. 建立共培养模型：分别用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养LX2、HepG2、HepG2/CYP2E1、HepG2/PCI细胞。取其对数生长期细胞，消化，计数，将HepG2、HepG2/CYP2E1、HepG2/PCI 3种细胞分别种于3个插入式培养皿中，细胞数均为3×106/L；相应将LX2细胞种3孔于6孔板中，细胞数均为6×105/L的（按照生理状态下肝细胞∶星状细胞=5∶1），用含10%的胎牛血清的DMEM培养过夜（约16h）。分别培养16h后去除LX2中培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗3遍后，将培养有HepG2、HepG2/CYP2E1、HepG2/PCI 3种细胞的插入式培养皿分别插到对应的培养有LX2的6孔板中，并将其培养基移入。形成共培养模型,共培养48h[2]。

7. 逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测共培养后3组LX2细胞的Ⅰ型胶原mRNA的表达：3组细胞分别共培养48h后，分别提取3组LX2细胞的总RNA。进行逆转录。设计引物：上游：5′-GGTT TGGAGAGAGCATGACC-3′，下游：5′-TTTGG GGAAATTGAGTTTGG-3′。PCR扩增片段长度为514bp。PCR条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，共38个循环。以GAPDH为内参照计算比值。

8. ELISA检测共培养后3组LX2细胞Ⅰ型前胶原羧基肽（procollagen type Ⅰ carboxy-terminal peptide，PICP）的分泌：应用PIP-ELISA试剂盒检测PICP。共培养48h后，分别收集3组细胞共培养时的上清液。建立标准曲线，加样，将反应板充分混匀后静置37℃孵育3h。洗板，加底物工作液，37℃孵育15min。加终止液混匀。在450nm处测吸光度（A）值。用标准品的吸光度绘制PICP标准曲线。根据样品A值在该曲线图上查出相应PICP含量。

9. RT-PCR检测共培养后3组LX2合成细胞MMP2 mRNA的表达：3组细胞分别共培养48h后，分别提取3组LX2细胞的总RNA进行逆转录。设计引物：上游：5′-TTTTTGTGCCCAAAGAAAGG-3′；下游：5′-ATGTCAGACAACCCGAGTCC-3′。PCR扩增片段长度为414bp。PCR条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，共40个循环。以GAPDH为内参照计算比值。

10. 明胶酶谱法检测共培养后3组LX2细胞外MMP2的酶活性：用双金鸡宁酸法测细胞培养上清液蛋白浓度，每孔上含20g蛋白的上清液，加入4×十二烷基硫酸钠非还原加样缓冲液5μl，参照Heussen等[3]的方法4℃条件下进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离胶为10%的聚丙烯酰胺凝胶，含明胶1g/ L (w/v)，浓缩胶为5%的聚丙烯酰胺凝胶。初始电压100V，当溴酚蓝指示线进入分离胶后，提高电压至120V，直至溴酚蓝移至凝胶底部。电泳结束后，凝胶置2.5% Tritonx-100中漂洗30min×2 次，浸入孵育缓冲液，37℃孵育24h。取出凝胶，用0.25%考马斯亮蓝R250染色2h，脱色液（45%甲醇, 10%乙酸）脱色0.5h，至蓝色背景下显现清晰的白色条带为止。用凝胶成像系统照相，并用Quantity one软件对zymography电泳结果进行灰度扫描，读取灰度值。

11. 统计学分析：采用SPSS13.0统计软件进行数据的分析处理，结果以x-±s表示。组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. 转染细胞稳定表达CYP2E1的鉴定：RT-PCR和Western blot结果显示，仅稳定转染PCI-CYP2E1的HepG2细胞（HepG2/CYP2E1）有CYP2E1基因mRNA和蛋白的表达，而转染PCI-neo空质粒的细胞则不表达，见图1，2。

2. CYP2E1对细胞产生脂质过氧化物MDA的影响：HepG2/CYP2E1细胞、阴性对照组HepG2细胞及HepG2/PCI细胞的MDA值分别为（6.51±0.25）nmol/ml、（3.07±0.29）nmol/ml和（2.57±0.29）nmol/ml， HepG2/CYP2E1细胞上清液分泌的脂质过氧化物MDA较阴性对照组、HepG2/PCI细胞组均明显增加，F＝22.66，P值均<0.01，差异有统计学意义。

3. 共培养后CYP2E1对LX2细胞产生羟脯氨酸的影响：HepG2/CYP2E1、HepG2/PCI及HepG2细胞分别与LX2共培养48h后，3组细胞培养液中Hyp含量分别是（35.24±3.52）nmol/ml、（17.77±2.58）nmol/ml和（24.50±1.37）nmol/ml， CYP2E1/LX2组细胞共培养液中分泌的Hyp量明显高于阴性对照组及PCI/LX2组，F＝58.89，P值均<0.01，差异有统计学意义。

4. 共培养后CYP2E1对LX2细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的影响：共培养后Ⅰ型胶原mRNA表达, HepG2/LX2组为1.25± 0.11、CYP2E1/LX2组为1.25± 0.11、PCI/LX2组为1.23±0.09，F＝0.73，P>0.05，3组间差异无统计学意义，见图3。

5. CYP2E1/LX2组、阴性对照组HepG2组及PCI/LX2组3组LX2分泌的PICP蛋白A值：共培养后，CYP2E1/LX2组、阴性对照组HepG2组及PCI/LX2组3组LX2分泌的PICP蛋白A值分别为540.01±11.38、262.57±15.61、231.59±12.76，共培养后CYP2E1/LX2组共培养液中分泌的PICP蛋白，与对照组、PCI/LX2组相比，明显增加，F＝124.97，P值均<0.01。差异有统计学意义。

6. 共培养后CYP2E1对LX2细胞MMP2 mRNA、酶活性表达的影响：共培养后LX2细胞的MMP2 mRNA水平（MMP2/GAPDH）：HepG2/LX2组为0.37±0.05、CYP2E1/LX2组为0.39±0.03、PCI/LX2组为0.36±0.04，F＝0.29，P>0.05，3组间差异无统计学意义，见图4。

7. CYP2E1对LX2上清液中MMP2酶活性的影响：共培养后培养液中MMP2酶活性（灰度值）：CYP2E1/LX2组为161.54±8.20、PCI/LX2组为164.83±9.27、HepG2/LX2组为163.73±9.08，F＝0.33，P>0.05，3组间差异无统计学意义，见图5。         

讨    论

LX2是活化状态的人HSC，它保留了肝星状细胞重要的特性，而且在血清培养基中保持着高存活率及高转染率，目前常用来进行肝纤维化方面的研究[4]。乙醇或高脂饮食可直接或间接活化肝细胞中CYP2E1，产生大量的活性氧，发生氧化应激，大量活性氧可通过与多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用并形成脂质过氧化物如MDA。故MDA的高低可间接反映机体细胞受活性氧攻击的严重程度[5-6]。本研究将含有人类CYP2E1完整基因的质粒载体转染入HepG2细胞，建立了稳定表达CYP2E1的HepG2细胞系，转染CYP2E1的HepG2细胞即HepG2/CYP2E1细胞，与阴性对照、转染空质粒的HepG2细胞即HepG2/PCI分别与LX2细胞共培养48h后，HepG2/CYP2E1组细胞产生的MDA含量显著高于阴性对照及HepG2/PCI组。从而间接证实CYP2E1基因可诱导肝细胞发生氧化应激。

羟脯氨酸在胶原组织中含量丰富，系胶原肽链合成后，在脯氨酸羟化酶作用下，将肽链上的脯氨酸羟化形成，同时已形成的胶原又在胶原酶作用下分解，释放羟脯氨酸，而胶原降解后，羟脯氨酸不再重复利用，从而使细胞外羟脯氨酸含量增加。羟脯氨酸是胶原特有的代谢产物，可间接反映胶原蛋白水平。本研究将HepG2/CYP2E1、HepG2/PCI、正常HepG2细胞分别与LX2细胞共培养48h后， CYP2E1/LX2组LX2细胞上清液分泌的羟脯氨酸含量明显高于其他组，证实CYP2E1促进星状细胞合成胶原等细胞外基质，也间接证实CYP2E1确实活化了星状细胞。

本研究将HepG2/CYP2E1、HepG2/PCI、正常HepG2细胞分别与LX2细胞共培养48h后，显示3组LX2在Ⅰ型胶原mRNA水平无影响。但CYP2E1/LX2组LX2分泌PICP蛋白明显增加。本研究结果与Nieto等[2]的实验结果一致，证实源自CYP2E1的活性氧，可以通过扩散，进入HSC，促进HSC分泌合成胶原，但CYP2E1对Ⅰ型胶原mRNA未发生明显影响。考虑CYP2E1对Ⅰ型胶原的影响可能在转录后水平。Nieto等[2]发现虽然转染CYP2E1的细胞与HSC共培养，与阴性组相比，HSC 内Ⅰ型胶原mRNA表达水平无明显区别，但与转染CYP2E1细胞共培养的HSC内Ⅰ型胶原mRNA的翻译效率较对照组提高了4倍，与转染CYP2E1细胞组HSCⅠ型胶原蛋白表达较对照组增高的倍数一致。提示mRNA翻译效率提高是转染CYP2E1组HSCⅠ型胶原表达提高的主要原因之一。De Crombrugghe和Schmidt[7]还发现在α1(Ⅰ)α2(Ⅰ)前胶原mRNA的翻译起始密码子周围，有1个由50个核苷酸组成的序列，十分醒目。这个序列在通过改变翻译效率，从而决定基因表达水平方面十分重要。而Guta等[8]发现当α1(Ⅰ)α2(Ⅰ)前胶原链在相同的内质网中平行合成时，它们延伸的效率却不平行。到底是氧化应激直接或间接的影响胶原的翻译启动密码子，或影响肽进入内质网，抑或是影响三聚螺旋体的形成，目前尚无定论，需要进一步研究探讨。

本研究将HepG2/CYP2E1、HepG2/PCI、正常HepG2细胞分别与LX2细胞共培养48h后，显示3组LX2细胞对MMP2基因的表达及其细胞外MMP2酶未产生明显影响，该结果也与Nieto等[2]的结果一致，考虑胶原合成与降解并不同步，大多数人认为胶原降解总落后于胶原合成，表现在转录后水平。尽管胶原蛋白的降解率对共培养模型中细胞外基质的重塑很重要，但发现I型胶原的半衰期仅有轻微差别；因此，当胶原合成速度不一样，降解速度差别近乎一致时，表现出胶原表达就有所不一致。

参   考  文  献

[1]Liu TH, Xu YQ, You H, et al. The expresision of CYP2E1 and its effect on the proliferation of C3A hepatocyte cell line. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2006, 14: 850-851. (in Chinese)

刘天会,徐有青,尤红,等.表达细胞色素2E1 C3A肝细胞系的建立及其对增殖的影响.中华肝脏病杂志,2006,14:850-851.

[2]Nieto N, Friedman SL, Cederbaum AI. Cytochrome P450 2E1-derived reactive oxygen species mediate paracrine stimulation of collagen I protein synthesis by hepatic stellate cells. J Biol Chem, 2002, 277: 9853-9864. 

[3]Heussen C, Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal Biochem, 1980, 102: 196-202.

[4]Xu L, Hui AY, Albanis E, et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2:new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut, 2005, 54: 142-151.

[5]Gholam PM, Flancbaum L, Machan JT, et al. Nonalcoholic fatty liver disease in severly obese subjects. Am J Gastroenterol, 2007, 102: 399-408.

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[7]De Crombrugghe B, Schmidt A. Structure and expression of collagen genes. Methods Enzymol, 1987, 144: 61-74.

[8]Gura T, Hu G, Veis A. Posttransciptional aspects of the biosynthesis of type I collagen pro-alpha chains: the effects of posttranscriptional modifications on synthesis pauses during elongation of the pro alpha 1 (I) chain. J Cell Biochem, 1996, 61: 194-215.

（收稿日期：2009-12-08）

（本文编辑：袁平戈）

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