罗格列酮对脂多糖诱导的核因子κB信号转导通路的影响

【关键词】  肝疾病； 信号转导； 内毒素类

The effect of Rosiglitazone, a PPARγ receptor agonist, on the NF-κB signaling pathway in acute hepatic  injury induced by LPS   LI Li-juan, XU Rui-ling.

【Key words】     Liver diseases;    Signal transduction;    Endotoxins

【First author’s address】   Jinci College, Shanxi Medical University, Taiyuan 030025, China

Email: rjnancy2006@ 163.com

本研究通过对小鼠内毒素脂多糖（LPS）急性肝损伤动物模型应用过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）的特异性激动剂罗格列酮，探讨其对LPS诱发的急性肝损伤中肝脏核因子（NF）-κB信号转导通路方面的影响。

一、材料与方法

1．实验动物与实验材料：雄性昆明种小鼠70只，体质量（25±2.9）g，由山西医科大学实验动物中心提供；内毒素购自美国Sigma公司；鼠源PPARγ抗体购自美国Santa Cruz公司；NF-κB P65、NF-κB P50和IκB多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化酶标记的羊抗鼠第二抗体购自北京中杉生物技术公司；罗格列酮购自北京高盟化工有限公司；DYY－Ⅲ8B型稳压稳流定时电泳仪、DYY－Ⅲ7B型转移电泳仪均购自北京六一仪器厂。

2. 实验方法：（1）动物分组和处理：70只小鼠于实验前1天下午禁食，饮水不限，将小鼠随机分为3组：对照组（n＝10）：0.9%等渗盐水＋18%二甲基亚砜，0.2ml/只，腹腔注射；LPS组（n＝30）：LPS溶于等渗盐水，剂量为5mg/kg，腹腔注射；罗格列酮预处理组（n＝30）：罗格列酮溶于18%二甲基亚砜，浓度为0.5mg/ml，剂量为6mg/kg，腹腔注射。罗格列酮注射1h后，腹腔注射LPS，剂量与LPS组相同。各组动物分别于处理后0.5h（n＝10）、1.5h（n＝10）、6h（n＝10），在注射戊巴比妥钠麻醉后开腹取肝脏，用Western blot检测肝脏NF-κB P65、NF-κB P50和IκB蛋白的表达。（2）肝脏组织总蛋白提取与定量：各组取-70℃冻存的肝组织200mg，置液氮中研碎，转入匀浆器中加入裂解液后匀浆，12500×g，4℃离心20min，取上清液。考马斯亮蓝法测定蛋白含量。（3）NF-κB P65、NF-κB P50和IκB的检测：采用Western blot，取等量蛋白20μg加样，以4%浓缩胶，12%分离胶（测IκB）和8%分离胶（测NF-κB P65和NF-κB P50）行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，将凝胶上的蛋白转印迹至偏二氟乙烯膜，转膜过夜后经5%脱脂奶粉于室温封闭2h，1×吐温-三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液漂洗3次，10min/次，然后分别加入1∶1000的相应信号转导蛋白抗体，4℃过夜。次日用1×吐温-三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液漂洗3次后，再加入1∶2000的针对第一抗体种属的辣根过氧化物酶标记的第二抗体，室温下摇荡2h，1×吐温-三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液漂洗3次。然后在暗室内将膜置入荧光发光液1～2min，用保鲜膜包盖偏二氟乙烯膜，置于X光胶片下曝光、显影和定影。（4） 图片数字化处理：将定影后的X光片图像用扫描仪转化为数码图像，用Quantity One（Bio-Rad）4.52软件，进行图像分析处理，获取图像吸光度值。

3. 统计学处理：使用SPSS11.5统计软件，数值以均数±标准差（x-±s）表示。单因素方差分析进行多样本均数的比较，采用LSD-t检验进行均数的两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

LPS诱导肝损伤后，随着时间的推移，NF-κB P65、NF-κB P50的表达逐渐减弱，于6h降至最低；IκB的表达逐渐增强，6h达其峰值。罗格列酮预处理组随着时间的推移，其NF-κB P65、NF-κB P50和IκB的表达变化趋势与损伤组相同，但与LPS损伤组相比，罗格列酮预处理组NF-κB P65、NF-κB P50各时间的表达均明显弱于损伤组，差异有统计学意义（P<0.05）；IκB于0.5h、6h的表达均明显强于LPS损伤组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1和表1。

三、讨论

研究证明LPS可促进IκBα亚型的降解并活化NF-κB的DNA结合能力，NF-κB可调节大量特异基因的转录，其产物在脓毒症的病理生理变化中起重要作用[1]。本研究对小鼠腹腔注射LPS后0.5h，即出现肝脏NF-κB P65和NF-κB P50磷酸化表达明显增强，其磷酸化表达随着时间推移逐渐减弱，IκB于腹腔注射LPS后，随着时间的推移表达逐渐增强，符合本信号通路在炎症情况下的变化趋势。罗格列酮预处理对LPS注射后0.5h所致肝脏NF-κB P65和NF-κB P50磷酸化表达与对照组相比虽增强，但各时间点表达均明显弱于损伤组，罗格列酮预处理组IκB的表达也随着时间的推移逐渐增强，但其各时间点表达明显强于损伤组，差异有统计学意义。这表明罗格列酮激活PPARγ受体后，其可能通过直接与NF-κB的亚基p65/p50结合，发生蛋白质-蛋白质相互作用，形成转录抑制复合物，降低了NF-κB与DNA 结合活性，抑制NF-κB DNA的合成，从而抑制其表达。近期研究表明，PPARγ抑制NF-κB靶基因的表达从而抑制炎症是由于配体依赖的PPARγ激活可导致炎症基因启动子的局限化，其可能和共抑制物形成有关[2]。此外，体外研究实验表明，配体可直接影响PPARγ和一些转录因子共激活物的相互作用，比如p300和CBP等，来抑制NF-κB的转录[3]。在LPS诱导的急性肝损伤发生过程中，PPARγ受体激动剂罗格列酮可通过激活PPARγ受体，抑制LPS介导的NF-κB信号通路，抑制炎症基因表达，从而减轻了LPS诱导的急性肝损伤。

参  考  文  献

[1]Liu SF, Malik AB. NF-kappa B activation as a pathological mechanism of septic shock and inflammation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2006, 290: L622-L645.

[2]Peraza MA, Burdick AD, Marin HE, et al. The toxicology of ligands for peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR). Toxicol Sci,2006, 90: 269-295.

[3]Abdelrahman M, Sivarajah A,Thiemermann C, et al. Beneficial effects of PPAR-gamma ligands in ischemia-reperfusion injury, inflammation and shock.Cardiovasc Res, 2005, 65: 772-781.