黄芪汤组分抑制胆汁淤积性肝纤维化大鼠胆管上皮细胞增殖及其转分化的效应

【摘要】  目的  探讨胆管上皮细胞增殖及其转分化在肝纤维化形成过程中的作用及黄芪汤组分抑制肝纤维化的效应和机制。 方法  30只SD雄性大鼠采用胆总管结扎制备胆汁淤积性肝纤维化模型，假手术对照组仅对胆总管作分离，不结扎。胆管结扎术后1周随机分为模型对照组和药物干预组（经灌胃给予黄芪汤组分4周），5周后麻醉下处死大鼠，获取肝组织与血清标本。检测肝功能、肝组织学及羟脯氨酸（Hyp）含量；激光共聚焦显微镜观察肝组织角蛋白-7（CK7）与α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）共定位，Western blot检测CK7、α-SMA蛋白表达。计量资料比较采用单因素方差分析中的LSD法或非参数检验中的H检验进行统计学分析，计数资料采用Radit检验，CK7与α-SMA蛋白表达间关系采用直线回归与相关分析。 结果  与假手术对照组比较，模型对照组大鼠病死率33.3%，腹水出现率90%，肝功能显著异常，肝组织肝细胞显著减少，胆管上皮细胞及纤维组织大量增生，肝组织Hyp含量、CK7及α-SMA蛋白表达显著增加（P值均<0.01），并有大量的CK7及α-SMA共定位阳性细胞表达。与模型对照组比较，药物干预组大鼠病死率、腹水出现率及脾脏质量均显著降低（P值均<0.05），肝功能显著改善，肝组织肝细胞减少及胆管上皮细胞与纤维增生程度轻，CK7与α-SMA共定位阳性细胞显著减少。药物干预组与模型对照组大鼠肝Hyp含量分别为（1026.8±132.47）μg/g和（887.4±95.56）μg/g，CK7表达量分别为0.812±0.298和0.318±0.143，α-SMA蛋白表达量分别为0.787±0.277和0.341±0.119，差异均有统计学意义（P值均<0.01）。 结论  黄芪汤组分可有效抑制胆管结扎大鼠胆管上皮细胞增生及胆管上皮细胞向α-SMA阳性的肌成纤维细胞的转分化。

【关键词】  胆汁淤积； 肝硬化； 胆管上皮细胞； 上皮-间质转分化； 黄芪汤

Huangqi decoction inhibits cholangiocyte proliferation and transdifferentiation in cholestatic liver fibrosis induced by BDL in rats   DU Jin-xing, QIU Bing-feng, LIU Ping, SUN Ming-yu, CHEN Gao-feng, LIU Jia. Key Laboratory of Liver and Kidney Diseases, Ministry of Education, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; Institute of Liver Diseases, Shanghai 201203, China

Corresponding author: LIU Ping, Email: liuliver@ shutcm.edu.cn

【Abstract】    Objective    To elucidate the antifibrotic mechanism of Huangqi decoction in rats with BDL-induced cholestatic liver fibrosis. Methods  Liver fibrosis model was induced by ligating the common bile duct (BDL) in rats. Sham-operation was performed in control rats. The BDL rats were randomly devided into two groups: the BDL group and the Huangqi decoction group. Huanqi decoction was given intragastrically for 4 weeks. At the end of the fifth week after BDL, animals were sacrificed. Results   Compared with the sham control group, mortality rate in BDL group was 33.3% and incidence rate of ascites was 90%, and hepatic function was abnormal in most of the rats in BDL group. The number of Hepatocytes was decreased   and the number of cholangiocytes significantly increased in BDL group. In addition, Hyp content of liver tissue and protein expression of CK 7 and α-SMA were significantly increased. Immunostaining indicated that CK 7 and α-SMA were co-localized in BDL group. These changes were markedly suppressed by the Huangqi decoction. Conclusions    These observations suggest that Huangqi decoction can inhibit cholangiocyte proliferation and cholangiocyte transdifferentiation.

【Key words】Cholestasis; Liver cirrhosis; Bile duct epithelial cells; Epithelial Mesenchmal transdifferentiation; Huangqi decoction

胆汁淤积是各种慢性肝病常见的病理变化[1]。既往研究结果认为，胆汁淤积后胆管上皮细胞增生是胆汁淤积性肝纤维化形成的重要因素[2-3]，但其确切机制尚存争议。最近有学者报道胆管上皮细胞在一定条件下可向α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）阳性的肌成纤维细胞转分化[4]。本课题组前期研究结果提示，中医益气方剂黄芪汤可有效干预大鼠胆汁淤积性肝纤维化[5]。本研究采用胆总管结扎制备继发性胆汁淤积肝纤维化大鼠模型，从胆管上皮细胞增生及其向α-SMA阳性的肌成纤维细胞转分化的角度出发，深入探讨黄芪汤组分干预大鼠胆汁淤积性肝纤维化的效应机制。

材料与方法

1．动物：SD雄性大鼠40只，无特定病原体级，体质量180～220g，购自中国科学院上海实验动物中心，许可证号：SCXK（沪）2005-0006。上海中医药大学实验动物中心饲养、造模和观察，自由饮食。

2．药物：黄芪汤由黄芪、炙甘草组成；所用药物均按《中华人民共和国药典》2000年版中的规定，采用道地药材，生药学专家鉴定并保存样品备查。各味药物分别制成粗粉末，加水共煎，浓缩煎出液经真空干燥制成干浸膏粉，由上海中医药大学附属曙光医院国家中医药管理局中药制剂中心（国家中医药管理局三级实验室）制备。采用乙酸乙酯、正丁醇分别对浸膏粉进行提取，2种提取物合并、然后上MCI凝胶柱层析，用30%甲醇洗脱，回收至干，所得粉末即黄芪汤组分。

3．主要试剂：肝功能检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，羟脯氨酸标准品购自日本ナカティテスク株式会社，蛋白质定量试剂盒购自美国Bio-Rad公司，抗角蛋白-7（cytokeratin-7，CK7）单克隆抗体购自英国Abcam公司，抗α-SMA单克隆抗体（isotype IgG2α）购自美国Sigma公司，抗3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体购自上海康成生物工程公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠抗体购自上海晶美生物技术公司，Western blot分析标记购自美国NEB公司，增强化学发光试剂盒购自美国Pierce公司，生物素结合抗小鼠IgG1购自美国BD公司，CY3结合链霉素及异硫氰酸荧光素第二抗体购自美国Jackson公司。

4．模型制备：40只大鼠标号后，随机分为10只假手术对照组与30只胆管结扎组；大鼠予戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射后，常规腹部皮肤消毒，沿腹正中线切开，暴露胆总管，假手术对照组仅分离胆总管后关腹；胆管结扎参照文献[6]的方法进行。

5．分组与用药：胆管结扎组大鼠胆总管结扎术后1周，随机分为模型对照组与药物干预组各15只，药物干预组大鼠于术后第2周开始给予黄芪汤组分（172.76 μg/g），假手术对照组与模型对照组大鼠给予等量等渗盐水。药物经口灌胃，1次/d，持续4周。

6．样品的采集和处理：术后5周，所有大鼠麻醉条件下打开腹腔，观察肝脏的大体形态及腹水情况，用注射器抽取腹水、称量；下腔静脉采血、分离血清；摘取肝脏、脾脏并称重，留取肝组织。

7．观察项目与方法：（1）一般情况：包括大鼠的皮肤黏膜颜色及形态、死亡情况、肝脏形态、肝脏及脾脏质地和质量、腹水形成情况等。（2）肝功能：按照南京建成生物工程研究所试剂盒的方法检测血清白蛋白（Alb）、总胆红素（TBil）、ALT、AST、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）及碱性磷酸酶（ALP）。（3）肝组织羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量按文献[7]方法测定。（4）肝组织学观察：肝组织经4%中性甲醛固定，石蜡切片，按常规方法行HE及天狼猩红染色，光镜下观察肝组织的病理变化。（5）肝组织CK7及α-SMA蛋白表达：Western blot检测。每组取8个样本，分别提取总蛋白，95℃～100℃变性5min后，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳2.5h，转膜（半干转）、封闭，然后加入第一抗体工作液（CK7与α-SMA，均为1∶1500稀释）4℃孵育过夜，洗涤后加HRP偶联的第二抗体室温孵育1h，洗涤、增强化学发光显影、曝光，同一张膜重新封闭，加入GAPDH抗体稀释液（1∶5000）作为内参照，应用复日FR-980生物电泳图像分析系统分析底片中的目的条带，计算机自动读取并记录每个条带的积分值，以样品积分值/内参照积分值比值进行统计学分析。（6）肝组织CK7及α-SMA免疫荧光共定位：肝组织冰冻切片（8μm），室温下复温30min后4%多聚甲醛固定，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，每次5min，3% H2O2孵育3min以消除内源性过氧化物酶，5%小牛血清封闭30min，单克隆抗CK7抗体（1∶200）37℃孵育120min，PBS洗3次，每次5min，生物素结合抗小鼠IgG1（1∶200）37℃孵育30min，CY3结合链霉素（1∶200）37℃孵育60min，PBS洗3次，每次5min；单克隆抗α-SMA（IgG2）抗体（1∶200）37℃孵育120min，PBS洗3次，每次5min，异硫氰酸荧光素第二抗体37℃孵育60min，PBS洗3次，每次5min，50%硝酸甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察。

8．统计学处理：采用统计分析软件SPSS13.0进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（x-±s）表示，所有资料先进行方差分析，如方差齐，则多组数据比较采用单因素方差分析中的LSD法；如方差不齐，则先采用非参数检验中的H检验进行统计，如组间差异有统计学意义，再采用两独立样本的秩和检验行组内各组比较，并用Bonferroni法对检验水准进行修正；计数资料采用Radit检验；采用直线回归与相关分析对肝组织CK7与α-SMA蛋白表达间关系进行分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

结    果

1．一般情况：假手术对照组大鼠无死亡，模型对照组死亡5只（33.3%），药物干预组死亡1只（6.7%）。与假手术对照组大鼠比较，模型对照组大鼠腹部膨隆，黏膜及巩膜黄染，大鼠肝脏表面粗糙，呈橘皮样，质地坚韧，肝脏、脾脏质量显著增加（Z值分别为3.780和3.781，P值均<0.05）；与模型对照组比较，药物干预组大鼠的腹部膨隆、黏膜黄染程度较轻，肝脏表面较为光滑，脾脏质量显著下降（Z＝2.842，P<0.05）；假手术对照组无腹水生成，模型对照组10只中9只出现腹水（90%），药物干预组14只中7只出现腹水（50%），显著低于模型对照组（P<0.01），见表1。

2．肝功能及肝组织Hyp含量变化：与假手术对照组比较，胆管结扎组血清ALT、AST、GGT及TBil含量显著增高（Z值分别为3.78、3.78、3.788及3.78，P值均<0.05），ALP活性增高（P<0.05），Alb含量显著下降（P<0.05）；肝组织Hyp含量显著增加（P<0.05）。与模型对照组比较，药物干预组血清Alb含量显著升高（P<0.05），血清AST、GGT及TBil含量显著降低（Z值分别为3.572、3.865及3.689，P值均<0.05），ALP含量显著降低（P<0.05）；肝组织Hyp含量显著降低（P< 0.05）。见表2。

3．肝脏组织学观察：肝组织HE染色显示：假手术对照组组肝小叶结构完整，肝索排列整齐，未见炎症细胞浸润；模型对照组大鼠肝细胞显著减少，形成大小不一的岛状结构，胆管上皮细胞显著增生，形成大量排列不规则的小胆管，其周围见少量炎性细胞浸润，天狼猩红染色见大量纤维增生；肝细胞显著减少，形成大小不一的岛状结构，胆管上皮细胞显著增生，形成大量排列不规则的小胆管，其周围见少量炎性细胞浸润。与模型对照组比较，药物干预组大鼠的胆管上皮细胞增生及肝细胞减少的程度显著减轻；纤维增生显著减少（见图1，2）。

4．肝组织CK7、α-SMA蛋白表达：大鼠胆管结扎后5周肝组织蛋白表达可见，模型对照组大鼠CK7、α-SMA显著高于假手术对照组（Z值分别为3.366和3.361，P值均<0.01）；与模型对照组比较，药物干预组大鼠肝组织CK7、α-SMA蛋白表达显著降低（Z值分别为3.366和3.151，P值均<0.01），见图3～图5；模型对照组与药物干预组大鼠肝组织CK7、α-SMA蛋白表达量的相关分析结果显示，两种蛋白质的表达量呈显著正相关（r＝0.9621，P< 0.01），见图6。

5．肝组织CK7、α-SMA免疫荧光共定位：采用激光共聚焦显微镜观察大鼠肝组织CK7/α-SMA免疫荧光共染发现，假手术对照组见少量CK7（红色）及α-SMA（绿色）阳性细胞，无CK7与α-SMA共染阳性细胞（黄色），而模型对照组大鼠见大量CK7及α-SMA阳性细胞，并见大量CK7与α-SMA共染阳性细胞，药物干预组大鼠CK7、α-SMA阳性细胞及CK7与α-SMA共染阳性细胞均明显少于模型对照组（图7）。

讨    论

胆管结扎是研究胆汁淤积性肝纤维化病理机制广泛采用的模型[6]。本研究结果显示，胆管结扎5周后，模型对照组有1/3大鼠死亡，存活大鼠中有90%出现明显腹水，血清肝功能显著异常；肝组织Hyp含量升高至假手术对照组的5倍，肝组织HE染色可见大量的胆管上皮细胞增生，在增生的胆管上皮细胞周围见大量胶原纤维沉积，正常肝细胞极度减少，炎症和坏死较轻，形成典型的胆汁淤积性肝硬化。与模型对照组大鼠相比，黄芪汤组分干预组大鼠死亡率、腹水形成率以及脾脏质量等均显著降低；肝功能诸指标除血清ALT外，均有显著改善，TBil含量、GGT、AST、ALP活性降低，Alb含量增加；肝组织Hyp含量显著降低，肝细胞的减少及胆管上皮细胞、纤维组织的增生程度明显减轻，较为充分地显示出黄芪汤组分对于继发性胆汁淤积性肝纤维化具有显著的干预作用。

肝星状细胞的活化是各种病因引起肝纤维化的中心事件，但对胆总管结扎模型大鼠肝脏α-SMA阳性的肌成纤维细胞的来源问题仍是目前研究的焦点之一。近年研究结果发现，除肝星状细胞外，肌成纤维细胞还可以来自其他细胞[8]。先前研究结果提示，在胆总管结扎后的72h内，肌成纤维细胞主要源于细胆管周围既存的成纤维细胞，此后则主要来自活化的星状细胞[9]；而新近由于上皮细胞-间充质细胞转分化研究的快速进展，更加关注胆管细胞、尤其是细胆管的重要作用。已有研究结果显示，在胆管结扎增生的细胆管与胆管细胞中可见到波形蛋白的表达[10]，大鼠胆汁淤积的病理条件下胆管上皮细胞可转分化为α-SMA阳性的肌成纤维细胞[4]。进一步的研究结果表明，包括胆道闭锁在内的慢性肝病的病理机制及病程进展过程均与胆管上皮的上皮细胞-间质细胞转化现象有关[11-12]；体外试验结果也已显示，TGFβ1可刺激胆管上皮细胞分化为间充质细胞[13]。

本研究采用胆管上皮细胞标志物CK7[14]及肌成纤维细胞标志物α-SMA[15]的免疫荧光共定位检测结果表明，胆总管结扎大鼠肝组织有大量的CK7与α-SMA共染阳性细胞表达；肝组织中此2种蛋白的表达量均显著增高，且两者表达量呈显著的正相关，提示α-SMA阳性的肌成纤维细胞可能主要来源于增生的胆管上皮细胞，即胆管结扎大鼠肝纤维化过程中存在明显的上皮细胞-间质细胞转化（胆管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化），而且可能是胆汁淤积性肝纤维化形成的关键因素之一。与同期模型对照组比较，药物干预组大鼠肝组织CK7与α-SMA蛋白表达量均显著降低，免疫荧光染色结果可见CK7与α-SMA阳性染色以及CK7与α-SMA共染色细胞均显著减少，提示黄芪汤组分不但能显著抑制胆管结扎大鼠胆管上皮细胞增生，也可有效地抑制胆管上皮细胞向肌成纤维细胞的转分化，这可能也是黄芪汤组分干预胆汁淤积性肝纤维化的主要效应机制之一。同时也预示黄芪汤组分在防治肝纤维化、尤其是胆汁淤积性肝纤维化中具有可期待的应用前景，值得进一步深入研究。

志谢    本研究的动物造模得到龙爱华博士的帮助

参  考  文  献

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