HBsAg树突状细胞疫苗对肝移植后免疫抑制状态大鼠抗HBs产生的影响

【摘要】  目的  观察乙型肝炎表面抗原（HBsAg）冲击的树突状细胞（DCs）疫苗对肝移植（LT）术后处于免疫抑制状态大鼠的抗-HBs产生的影响。 方法  Lewis大鼠LT术后(BN大鼠为供体）给予大剂量他克莫司（FK506，2mg/kg)，建立LT术后免疫抑制状态的动物模型，并随机分为两组。术后14d及28d，经腹腔注入HBsAg-DCs疫苗者为HBsAg-DCs组（15只），连续观察12周，注入HBsAg 疫苗200μl者为HBsAg组（15只）；未予免疫抑制的LT术后Lewis大鼠为对照组（5只）。切取肝脏组织行光、电镜检查；RT-PCR检测脾脏白细胞介素（IL）-2、干扰素（IFN）γ mRNA表达水平；酶联免疫吸附法检测血清IL-2、IFNγ及抗-HBs水平。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。 结果  大剂量FK506使HBsAg-DCs组及HBsAg组动物处于高度免疫抑制状态，肝脏无排斥反应、IL-2及IFNγ表达水平明显低于对照组，t值为21.35～48.74，P值均<0.05；HBsAg-DCs组在疫苗注射后1、2、3个月均能检测到高滴度的抗-HBs，分别为（255.24±34.16）IU/L、（145.11±12.37）IU/L、（185.43±17.18）IU/L，明显高于HBsAg组（抗-HBs几乎为0），t值分别为45.24、47.69、58.38，P值均<0.05。 结论  在LT术后处于免疫抑制状态的大鼠体内，HBsAg-DCs疫苗仍能诱导出高血清滴度的抗-HBs。

【关键词】  肝移植； 免疫抑制； 肝炎病毒，乙型； 树突状细胞

Effects of HBsAg pulsed dendritic vaccination on anti-HBs production in immunosuppressed rats after liver transplantation   LI Yue*, CHEN Xian-feng, LIU Zuo-jin, GONG Jian-ping, LI Sheng-wei. *Department of Hepatobiliary Surgery, Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China

Corresponding author: LI Sheng-wei, Email: cqlsw@ yahoo.com.cn

【Abstract】    Objective    To explore the effects of HBsAg pulsed dendritic vaccination on anti-HBs production in immunosuppressed rats after liver transplantation (LT). Methods    Brown-Norway liver allografts were transplantated into Lewis reipients. The transplantated Lewis rats were injected with EK506 (2 mg/kg) and randomly divided into two groups: rats in HBsAg-DCs group (n = 15) were intraperitoneally injected with HBsAg pulsed DCs at 14 d and 28 d after LT, and rats in the HBsAg group (n = 15) were injected with HBsAg (200μl) once a week for 12 weeks. Rats without any immunosuppressive treatment after LT served as controls (n = 5). IL-2 and IFNγ mRNA expression in spleen were analyzed by RT-PCR, serum IL-2, IFNγ and anti-HBs were detected by ELISA. Results    High dose of FK506 resulted in the immunosuppressed in LT rats, as evident by low production of IL-2 and IFNγ, and without liver rejection compared to rats in the control group. HBsAg-DCs induced high titer of anti-HBs antibody, however, titer of anti-HBs were seldom detectable in the HBsAg group at 1, 2 and 3 mouth after vaccination. Conclusion     The capacity of HBsAg-DCs to induce anti-HBs in immunosuppressed rats suggested that DC vaccine may prevent HBV recurrence in liver transplantated patients.

【Key words】Liver transplantation; Immune depression; Hepatitis B virus; Dendritic cell

如何有效预防HBV再感染仍是目前肝移植（liver transplantation, LT）术后亟待解决的一个难题[1]。LT术后免疫抑制剂的使用是导致普通乙型肝炎疫苗主动免疫失败的主要原因[2]。树突状细胞（DCs）是体内广泛分布的抗原提呈细胞，在诱导T淋巴细胞介导的针对病毒的特异性免疫反应中发挥着重要作用。和裸抗原相比，相关抗原冲击后的DCs能有效激活初始型T淋巴细胞（naive T cell）以及记忆淋巴细胞进而诱导高效、特异的主动免疫[3]。因此，我们通过观察乙型肝炎表面抗原（HBsAg）冲击的DCs疫苗对LT术后处于免疫抑制状态大鼠的抗-HBs产生的影响，进而探讨了该疫苗临床应用的可行性。

材料与方法

1．实验动物与试剂：雄性Lewis大鼠（RT11）、Brown-Norway（BN）大鼠（RT1n），鼠龄10～12周，体质量240～280g，购自中国医学科学院实验动物研究所。他克莫司（FK506）购自日本Fujisawa 制药有限公司；大鼠重组白细胞介素(IL)-4和粒巨细胞集落刺激因子（granulocyte/macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）购自美国R&D公司。异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的CD80、CD86及CD11c的兔抗鼠单克隆抗体购自美国BD Pharmingen公司；HBsAg疫苗购自深圳康泰生物制品公司。IL-2、干扰素（IFN）γ及抗-HBs测定用ELISA试剂盒购自美国BioSource公司；总RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒购自美国Promega公司。寡核苷酸由华大-上海鼎安生物科技有限公司合成。

2．HBsAg-DCs疫苗的制备参照文献[3]进行：无菌取出BN大鼠股骨和胫骨,冲洗骨髓腔，Tris/NH4Cl裂解红细胞，收集骨髓细胞。用含GM-CSF（100ng/ml）和IL-4（50ng/ml）的RPMI 1640完全培养基重悬。于37℃、5% CO2培养3h，洗出非黏附细胞。调整细胞浓度为1×108个/ml，加入6孔培养板中, 每孔加入上述培养基至2ml；隔日半量换液1次，于37℃、5% CO2培养箱中培养7d。第7天，调整细胞浓度为3×106个/ml，加入完全培养基（1.0ml含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640内加入100μg的HBsAg），继续培育48h，收集悬浮的细胞即为HBsAg致敏的DCs疫苗。收集DCs，PBS洗3次后与FITC标记的CD80、CD86及CD11c的单克隆抗体在4℃反应30min后，用流式细胞仪（购自美国BD Biosciences公司）检测其纯度和成熟度。

3. 肝移植术后免疫抑制状态大鼠模型的建立及分组：参照本实验室改进的Kamada两袖套法建立的同种异体急性排斥反应原位肝移植模型[4]。参照Furukawa等[5]的方法对移植成功后的大鼠立即经腹腔注射FK506，2.0mg·kg-1·d-1，连续4个月，建立术后处于极度免疫抑制状态的大鼠肝移植模型。将大鼠随机分为两组，于LT术后14d及28d，将制备的HBsAg-DCs，调整细胞浓度为5×106个/ml，经腹腔注入者为HBsAg-DCs组（15只）；经后肢皮下注射HBsAg疫苗200μl (含HBsAg 6μg,相当于人产生抗体剂量的180倍)，每周1次，连续12周者为HBsAg组（15只）。两组大鼠均于疫苗注射后1、2、3 个月分为3个亚组（每个亚组5只），并处死动物。同时以未予任何免疫抑制剂处理的LT术后Lewis鼠为对照组（5只，术后第7天处死）。

4．血清IL-2、IFNγ、抗-HBs的测定：采集各亚组肝下腔静脉血液5ml。根据酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒说明，测定血清IL-2、IFNγ、抗-HBs浓度。最低检测值（敏感度）为1.0pg/ml。

5．脾脏IL-2、IFNγmRNA表达水平的测定：采用RT-PCR法测定脾脏IL-2、IFNγ mRNA表达水平。参照试剂盒说明书提取脾脏组织的总RNA，逆转录为cDNA后进行PCR反应。PCR引物：IL-2上游引物为5′-TGCTCGAGACACACT GCATCTTGGC-3′，下游引物为5′-CGGGTACCA TGAGCTCATTGAATGC-3′，扩增产物409bp；IFNγ上游引物为5′-TGCTCGAGACTTCAAG CTCTACAGC-3′，下游引物为5′-CGGGTA CCATGCTTTGACAGAAGGC-3′，扩增产物380bp；内参照β-肌动蛋白上游引物为5′-CAT TGTGATGGACTCCGGAG-3′，下游引物为5′-ATAGTGATGACCTGGCCGTC-3′，扩增产物300bp。RT-PCR产物的电泳条带（质量体积分数为20g/L的琼脂糖凝胶电泳），采用美国Bio-Rad公司Quantity 4.0图像分析软件行扫描分析。

6．肝脏组织学检查：切取肝左外叶组织，储存于4%甲醛溶液，石蜡包埋切片后，苏木素-伊红染色后行光镜检查；固定于含2.5%戊二醛的缓冲液者，40℃过夜，然后行透射电镜（Philips EM208, 购自美国Philips公司）检查，重点观察肝脏实质细胞及内皮细胞的超微结构改变。

7. 统计学方法：数据以均数±标准差（x-±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结    果

1．FK506对肝移植术后Lewis鼠免疫抑制效应的评估：在大剂量FK506的作用下，HBsAg-DCs及HBsAg组均处于几乎完全的免疫抑制状态。1、2、3个月各亚组脾脏的IL-2、IFNγ mRNA几无表达（图1，图2），血清IL-2、IFNγ表达水平极低（表1），与对照组相比，差异有统计学意义，P<0.05；光镜下，参照Kemnitz的排斥反应分级，HBsAg-DCs及HBsAg各亚组移植肝脏均未见排斥反应（图3A，3B）。而对照组汇管区可见大量的淋巴细胞浸润，范围明显增宽，小叶间静脉内皮细胞表面及内皮细胞下有多量淋巴细胞浸润，中央静脉周围肝细胞有严重脱失，诊断为3级重度排斥反应（图3C）。电镜下：HBsAg-DCs及HBsAg组肝细胞多边形，糖原及内质网丰富，无扩张，线粒体等细胞器无明显肿胀，血窦不扩张（图4A，4B）；对照组肝细胞线粒体中、重度肿胀，内质网明显扩张，血管内皮明显肿胀，部分内皮消失，完全暴露的肝细胞大部分膜结构被破坏，可见坏死的肝细胞（图4C）。

2. HBsAg-DCs疫苗对免疫抑制状态下的Lewis鼠抗-HBs产生的影响：尽管只进行了两次HBsAg-DCs疫苗主动免疫，HBsAg-DCs组处理1个月时即获得高血清滴度的抗-HBs，第2、3个月虽略有下降，但仍然维持在较高水平，而HBsAg组虽反复给予超大剂量的HBsAg，其各时点的血清抗-HBs几乎为零，两者差异有统计学意义，P<0.05（表2）。

讨    论

HBV感染相关终末期肝病仍然是我国LT的最常见原因。如果缺乏有效的预防措施，HBV DNA阳性的受者术后HBV感染复发率可高达85%，而复发后2年病死率则高达50%[6]。因此，如何预防HBV再感染仍是目前LT术后亟待解决的一个难题[7]。联合应用拉米夫定和乙型肝炎免疫球蛋白是目前最佳的预防方案，但存在需连续用药（致价格高昂）、长期应用会导致病毒变异而再激活等缺点[8]。由于机体主要是通过细胞毒性T淋巴细胞杀伤感染的肝细胞和释放抗病毒的细胞因子（抗-HBs）来清除HBV，因此，维持血清高滴度的抗-HBs是防治HBV再激活的关键[9]。

DCs是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，且所有抗原提呈细胞中惟有DCs才能激活初始型T淋巴细胞[10]。HBsAg需要经由DCs吞噬、处理提呈给淋巴细胞后才能产生抗-HBs。但HBV感染受者常存在DCs功能缺陷，同时LT术后必需的免疫抑制治疗将进一步抑制DCs的功能，造成T、B淋巴细胞对HBV免疫耐受，因此，即使反复给予HBV疫苗或辅以各种佐剂，也不能获得有效的血清抗-HBs[2]。显然，恢复DCs的免疫功能进行主动免疫治疗是预防HBV再感染的重要手段。有研究结果显示，提取DCs，用HBsAg冲击培养后可提高其成熟度、增强抗原提呈功能，该DCs回输后明显上调其介导的特异性免疫反应而解除机体对HBV的免疫耐受，有效清除HBV[10]。但是，目前鲜见LT术后，机体处于免疫抑制状态下，该DCs疫苗疗效的报道。

本研究结果显示，和处于中、重度急性排斥反应的对照组相比较，两处理组均处于几乎完全抑制的免疫状态（肝脏排斥反应完全被抑制，IL-2及IFNγ几无表达），即使反复给予相当于人体产生抗体剂量180倍的HBsAg, 也不能获得抗-HBs，进一步证实了大量免疫抑制剂应用后，该动物模型对普通HBsAg疫苗（裸抗原）的免疫无应答。但同时仅需间断两次给予HBsAg冲击的DCs疫苗，HBsAg-DCs组就可获得并维持较高滴度的抗-HBs，表明即使处于术后极度免疫抑制状态下，该疫苗仍能发挥其强大的主动免疫效能。

为符合临床实际，本实验中我们采用供体（异）基因源性DCs进行实验。异基因成熟DCs回输必然会增强宿主的免疫反应，虽然理论上讲，由特异抗原激发的DCs通常只会导致针对相应抗原的特异性免疫反应，不过活化DCs所激发的与排斥反应相关的IL-2、IFNγ、TNFα等炎症因子所产生的效能并无抗原特异性[11-12]。而本实验为观察DC疫苗的免疫效能，给予了过量的免疫抑制剂，极有可能掩饰这些炎症因子所造成的排斥反应。因此，该疫苗能否用于临床，尚需进一步观察是否会诱导及加重肝脏排斥反应（使用正常免疫抑制剂量）及其程度是否可控制等问题。

参  考  文  献

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