芳香烃受体核易位蛋白2基因表达对HCCLM6细胞侵袭和迁移的影响

【摘要】  目的  探讨短发夹（sh）RNA-芳香烃受体核易位蛋白（ARNT）2i慢病毒表达载体对高转移肝癌细胞HCCLM6侵袭和迁移的影响。 方法  以ARNT2为目的基因，化学合成4条干扰RNA，与经MluⅠ和ClaⅠ酶切后的pLVTHM载体连接过夜，筛选并鉴定阳性克隆。利用脂质体2000将shRNA-ARNT2i, pCMV-dR8.74, pMD2G共转染293T细胞，获得shRNA-ARNT2i慢病毒颗粒，进一步感染HCCLM6靶细胞，并分为转染shRNA-ARNT2i组、未转染的空白对照组和转染阴性对照序列组。用荧光实时定量PCR和Western blot检测ARNT2基因的干扰效率。应用划痕和Boyden小室法观察ARNT2表达下调对HCCLM6侵袭和迁移能力的影响。用SPSS16.0统计软件对数据进行独立样本t检验和方差分析，其中多组资料两两比较采用LSD法。 结果  荧光实时定量PCR检测转染shRNA-ARNT2i组,未转染的空白对照组和转染阴性对照序列组3组ARNT2 mRNA相对表达值分别为0.154±0.024、0.860±0.145、1.004±0.009, F＝113.14, P<0.01，差异有统计学意义；Western blot显示转染shRNA-ARNT2i组ARNT2蛋白的表达量为16.45±1.6，转染阴性对照序列组ARNT2蛋白的表达量为44.56±2.07, 两组比较，t＝18.58, P<0.01，差异有统计学意义；转染shRNA-ARNT2i组细胞在划痕48h后基本愈合，而转染阴性对照序列组和未转染的空白对照组划痕依然可见；转染shRNA-ARNT2i组穿膜细胞数为（13.25±1.04）个，而未转染的空白对照组和转染阴性对照序列组的穿膜细胞数分别为（6.50±2.56）个、（6.75±2.05）个, F＝29.645，P<0.01，差异有统计学意义。 结论  shRNA-ARNT2i载体能显著下调HCCLM6细胞ARNT2基因和蛋白的表达，促进HCCLM6细胞的运动和侵袭。

【关键词】  癌，肝细胞； 侵袭，肿瘤； 迁移，细胞； 芳香烃受体核易位蛋白

Effects of ARNT2 gene on invasion and migration of human hepatocellular carcinoma HCCLM6 cell line   LI Wei-wei, WU Wei-zhong, LIANG Ying, XIAO Chun-li, TAO Zhong-hua, WANG Lu, SUN Hui-chuan, FAN Jia. Liver Cancer Institute and Zhongshan Hospital, Fudan Unviersity, Shanghai 200032, China

Corresponding author: WU Wei-zhong, Email: wu.weizhong@ zs-hospital.sh.cn

【Abstract】    Objective    To investigate the effects of ARNT2 on invasion and migration of HCCLM6 cells. Methods    Four short hairpin oligoes targeting to ARNT2 were s cloned into the pLVTHM vecto. Lentiviral vectors shRNA-ARNT2i, pCMV-dR8.74 and pMD2G were cotransfected into 293T cells using Lipofectamine 2000. HCCLM6 was infected with virus supernatant. ARNT2 mRNA and protein expressions were detected using quantitative Real time-PCR and Western blot, respectively. The invasion and migration of HCCLM6 cells were evaluated using wound healing assay and cell invasion assay in vitro. Statistical analysis was performed with SPSS 16.0. Results    The relative mRNA levels of ARNT2 were 0.154±0.024, 0.860±0.145, 1.004±0.009 in shRNA-ARNT2i virus infected HCCLM6 cells, mock-infected cells and control vector virus infected cells (F = 113.14, P < 0.01). The expression of ARNT2 at protein level was 16.45±1.6, 44.56±2.07 in the HCCLM6 cells infected with shRNA-ARNT2i virus and negative control vector virus, respectively (t = 18.58, P < 0.01). The scrape wound of HCCLM6 cells infected with shRNA-ARNT2i virus healed faster than cells infected with control vector virus or mock-infected cells. The number of cells invading through Matrigel was higher in the HCCLM6 cells infected with shRNA-ARNT2i virus (13.25±1.04) than that in mock-infected HCCLM6 cells and the HCCLM6 cells infected with negative control vector virus (6.50±2.56, 6.75±2.05) (F = 29.645, P < 0.01). Conclusion    Inhibition of ARNT2 gene promotes the invasion and migration of HCCLM6 cells.

【Key words】Carcinoma, hepatocellular; Invasiveness, neoplasm; Migration, cell; Ah receptor nuclear translocator protein

最近研究结果显示芳香烃受体核易位蛋白（ah re-ceptor nuclear translocator protein，ARNT）2在乳腺癌组织中也有表达，并且表达程度与乳腺癌患者的预后相关[1]。本研究应用RNA干扰技术构建ARNT2基因特异性shRNA慢病毒载体，探讨ARNT2在肝癌中所介导的作用。

材料与方法

1. 材料：慢病毒载体系统购自瑞士Tronolab公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自美国NEB公司；大量质粒DNA抽提试剂盒购自德国Qiagen公司；Taq DNA聚合酶购自日本TaKaRa公司；HCCLM6细胞由复旦大学附属肝癌研究所克隆和保存；293T病毒包装细胞购自美国BD公司；高糖DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；RNA逆转录试剂盒购自美国Promega公司；聚偏二氟乙烯膜购自美国Millipore公司；兔抗人ARNT2抗体购自美国Santa Cruz公司；基质胶购自美国BD公司；Boyden小室购自美国Costor公司。

2. ARNT2基因shRNA慢病毒载体的构建和鉴定：按照RNA干扰序列的设计原则合成4条针对ARNT2基因的shRNA寡核苷酸序列。分别构建质粒并转染293T细胞，根据其对ARNT2的抑制率确定有效的靶序列：5′-GAGAGAATCATAGTGA AAT-3′，同时设立阴性对照序列为：5′-AAGAGG CTTGCACAGTGCA-3′。人工合成含MluⅠ和ClaⅠ酶切位点的寡核苷酸DNA，退火形成双链经酶切后连接到pLVTHM载体中，并转化DH5a感受态细胞，挑取重组阳性克隆进行PCR鉴定并由上海美季生物技术有限公司测序鉴定。PCR鉴定阳性克隆的引物为：上游引物为5′-GTGTCACTAGGCGGGA ACAC-3′，下游引物为5′-TTATTCCCATGCGA CGGTATC-3′。

3. 慢病毒的包装及滴度的测定：转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期293T细胞，调整细胞密度至6×105个/ml，接种于15cm细胞培养皿中，置37℃，5% CO2中常规培养。待细胞密度达70%～80%时进行质粒转染。用硼酸盐缓冲液和氯化钙溶液预先配置慢病毒包装系统中3种质粒DNA (含pLVTHM 10μg，pCMV-dR8.74 5μg，pMD2G 3.5μg),室温放置20～30 min后，逐滴加至293T细胞中并连续转染12h。经磷酸盐缓冲液洗涤3次后，用10ml含10%胎牛血清的细胞培养基替换转染液并继续培养48h。收集转染72h后293T细胞的上清液。先在4℃，4000×g离心10min，经0.45μm过滤后再在4℃、25000r/min离心90min，沉淀病毒颗粒用磷酸盐缓冲液4℃溶解过夜，分装病毒液置-70℃保存备用。用DMEM培养液调整293T细胞至5 ×105个/ml, 以100μl/孔铺96孔板。 以10倍梯度稀释病毒颗粒原液。弃原培养液，加45μl/孔病毒颗粒稀释液感染293T细胞。36h后用新鲜含10%胎牛血清的培养液替换病毒稀释液。72h后在倒置荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白表达量,计算病毒滴度。

4. 目的基因导入HCCLM6细胞：用胰酶消化对数生长期HCCLM6细胞，制成2×104个/ml单细胞悬液，接种于12孔细胞培养板中；12h后弃上清液,加入适量慢病毒颗粒感染细胞，感染3d后观察慢病毒报告基因绿色荧光蛋白的表达情况，感染效率大于50%者继续培养，并进行靶基因干扰效率的PCR筛选，将基因导入后的HCCLM6细胞分为转染shRNA-ARNT2i组、未转染的空白对照组和转染阴性对照序列组。

5. 检测ARNT2 mRNA和蛋白的表达水平：常规提取细胞总RNA和总蛋白。将细胞总RNA逆转录成cDNA。取1μl cDNA，在55℃退火温度下分别扩增ARNT2基因（187bp）和肌动蛋白基因（302bp）。ARNT2上游引物为5′-GACTCACTTC CTCGCTCAC-3′，下游引物为5′-GCCATCCTG TTGCCATCAC-3′。肌动蛋白上游引物为5′-GTC GGTGTGAACGGATTT-3′，下游引物为5′- ACTCCAC GACGTACTCAGC-3′。采用相对定量2-ΔΔCt法比较ARNT2在各组中的表达差异。取30μg细胞总蛋白进行聚丙烯酰胺电泳分离，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，用兔抗人ARNT2抗体和羊抗兔IgG抗体进行免疫杂交，用ECLplus进行显色，计算目的基因和蛋白的相对含量及干扰效率。

6. HCCLM6细胞侵袭和迁移能力的测定：（1）细胞迁移实验：将细胞分别接种于24孔板，贴壁后改用含3%胎牛血清的DMEM培养液，待细胞长至70%～80%汇合度时用无菌移液器枪头沿培养板底部划“ 一”字形划痕，无血清培养液冲洗若干次, 以洗去被划下的细胞。在倒置显微镜下观察划痕后0、24、48h和72h细胞的迁移能力。（2）细胞穿膜实验：将DMEM液8倍稀释的10μl基质胶铺在直径为8μm的Boyden小室膜上，风干备用。用DMEM稀释液将对数生长期细胞制成5×105个/ml单细胞悬液，分别取200μl加入上室，下室均加入500μl含10%胎牛血清的DMEM培养液。培养36h后，用4%多聚甲醛和吉姆萨染液固定并染色上室细胞，在显微镜下计数侵袭到小室背面的细胞数。每次实验各组细胞设3个复孔，共重复3次。

7. 统计学处理：计量资料采用均数±标准差（x-±s）表示，用SPSS16.0统计软件对数据进行独立样本t检验和方差分析，其中多组资料两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. 慢病毒shRNA-ARNT2i表达载体的鉴定结果：阳性克隆的酶切产物大小为343bp，而阴性克隆为306bp，PCR扩增产物的大小（图1）以及插入寡核苷酸链的序列与预期结果（图2）相符。

2. 重组慢病毒的滴度测定结果：病毒滴度为带有荧光的细胞数除以病毒原液量表示。本次实验制备的慢病毒滴度为1×108TU/ml。

3. ARNT2基因和蛋白的沉默效率：荧光实时定量PCR检测转染shRNA-ARNT2i组,未转染的空白对照组和转染阴性对照序列组3组ARNT2 mRNA相对表达值分别为0.154±0.024、0.860±0.145、1.004±0.009, F＝113.14, P<0.01，差异有统计学意义；与转染shRNA-ARNT2i组比较，未转染的空白对照组和转染阴性对照序列组的mRNA相对表达值均较小，P值均为0.0000,差异均有统计学意义；转染阴性对照序列组与未转染的空白对照组比较，差异无统计学意义。Western blot显示转染shRNA-ARNT2i组C蛋白的表达量为16.45±1.6，转染阴性对照序列组ARNT2蛋白的表达量为44.56±2.07, 两组比较，t＝18.58，P<0.01，差异有统计学意义，见图3。

4.ARNT2对HCCLM6迁移和侵袭的影响：划痕实验结果显示转染shRNA-ARNT2i组细胞在划痕48h后基本愈合，而转染阴性对照序列组和未转染的空白对照组划痕依然可见，见图4。提示下调ARNT2的表达可明显促进HCCLM6细胞的迁移能力。侵袭试验结果显示转染shRNA-ARNT2i组穿膜细胞数为（13.25±1.04）个，而未转染的空白对照组和转染阴性对照序列组的穿膜细胞数分别为（6.50±2.56）个、（6.75±2.05）个（图5），F＝29.645，P<0.01，差异有统计学意义；与转染shRNA-ARNT2i组比较，未转染的空白对照组和转染阴性对照序列组的穿膜细胞数均较小，P值均为0.0000，差异均有统计学意义；转染阴性对照序列组与未转染的空白对照组比较差异无统计学意义。

讨    论

ARNT2为细胞核内重要的转录因子，它属于碱性螺旋-环-螺旋转录因子超家族中新发现的PAS亚家族，该家族的成员均以一个高度保守的毗邻于螺旋-环-螺旋二聚化区域的碱性DNA结合序列为特征，是一类生物传感器。该家族成员还包括缺氧诱导因子、芳香烃受体、果蝇神经细胞发育调节因子等。近年来，越来越多的报道显示bHLH/PAS超家族中的几个成员均参与肿瘤的进展过程。例如，缺氧诱导因子与ARNT形成复合物启动肿瘤血管形成相关基因的表达，参与了肿瘤的进展[2-3]。Abdelrahim等[4]使用小RNA干扰技术下调人乳腺癌细胞系MCF-7和肝癌细胞系HepG2中芳香烃受体基因的表达后，发现人乳腺癌细胞系MCF-7的增殖出现明显加快。相反，HepG2细胞的增殖却出现了明显的抑制效应，同时伴随细胞周期相关调节因子的表达改变。该研究结果提示芳香烃受体可以显著影响肿瘤细胞在体外生长和增殖，并且在不同来源肿瘤细胞中可能有截然相反的作用。Laffin等[5]研究报道，在原发性乳腺癌中经常出现一种ARNT同源因子SIM2s的缺失或下调，动物实验结果显示SIM2s的缺失可导致小鼠乳腺导管畸形发育及恶变，下调人乳腺癌细胞系MCF-7中SIM2s的表达，可导致上皮间质化生，并增加成瘤率。作为bHLH/PAS家族的重要成员之一的ARNT2也可以形成HIF1复合物启动血管形成相关基因的表达，发挥和ARNT类似的功能[6]。然而，关于ARNT2在肿瘤生长和侵袭转移中的研究报道甚少。我们曾经在多株人肝癌细胞系中发现ARNT2分子的表达，并且发现ARNT2的表达水平在不同转移潜能的肝癌细胞系中存在差别，提示ARNT2与肝癌的转移性状有一定的关系（待发表）。为了探索ARNT2分子在肝癌侵袭转移中的作用以及分子调节机理，我们运用RNA干扰技术，构建了四个针对ARNT2的shRNA-ARNT2i病毒重组体。发现其中一对寡核苷酸可有效抑制肝癌细胞HCCLM6中的ARNT2基因和蛋白质表达。在此基础上用细胞划痕和侵袭实验进一步探讨了ARNT2表达改变对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。发现 ARNT2表达下调后细胞的侵袭能力显著增强，迁移加快，提示ARNT2参与了肝癌细胞侵袭转移过程。上述结果显示，ARNT2基因是一个新的肝癌转移调节基因，为日后的肿瘤生物学功能及分子机制研究打下了基础。ARNT2有望成为肝癌转移治疗上有前途的分子靶点。

参  考  文  献

[1]Martinez V, Kennedy S, Doolan P, et al. Drug metabolism-related genes as potential biomarkers: analysis of expression in normal and tumour breast tissue. Breast Cancer Res Treat, 2008, 110: 521-530.

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[3]Amir S, Wang R, Matzkin H, et al. MSF-A interacts with hypoxia-inducible factor-1alpha and augments hypoxia-inducible factor transcriptional activation to affect tumorigenicity and angiogenesis. Cancer Res, 2006, 66: 856-866.

[4]Abdelrahim M, Smith R, Safe S. Aryl hydrocarbon receptor gene silencing with small inhibitory RNA differentially modulates Ah-responsiveness in MCF-7 and HepG2 cancer cells. Mol Pharmacol, 2003, 63: 1373-1381.

[5]Laffin B, Wellberg E, Kwak HI, et al. Loss of singleminded-2s in the mouse mammary gland induces an epithelial-mesenchymal transition associated with up-regulation of slug and matrix metalloprotease 2. Mol Cell Biol, 2008, 28: 1936-1946.

[6]Hill AJ, Heiden TC, Heideman W, et al. Potential roles of Arnt2 in zebrafish larval development. Zebrafish, 2009, 6: 79-91.