两种细胞制作的人肝癌裸鼠模型转移性状的比较

【摘要】  目的  比较两种人肝癌细胞株（HCCLM3和SMMC-7721细胞）构建的人肝癌裸鼠模型的转移潜能。 方法  实验分为两组：应用HCCLM3细胞构建的人肝癌裸鼠模型组为A组，SMMC-7721细胞构建的模型组为B组。比较A组和B组的原发灶的肿瘤大小和病理检查结果。比较各组的肝内转移率、转移数目，累及的肝叶数以及转移肿瘤体积的大小。所有数据由SPSS16.0软件分析，计量资料采用t检验，率的比较采用Fisher确切概率法，计数资料采用秩和检验。 结果  A组的肝内转移率为100%（8/8）、肝内原发肿瘤体积为（6954±1945）mm3，B组的肝内转移率为62.5%（5/8）、肝内原发肿瘤体积为（6034±2035）mm3，两组肝内转移率和原发灶肿瘤体积大小比较，差异无统计学意义。肝内转移的数目、累及肝叶数、转移肿瘤的体积大小A组分别为4.5个（中位数）、3个和975mm3（中位数），B组分别为1个（中位数）、1个和274mm3（中位数），两组比较，Z值分别为-2.818、-2.289和-1.975, P值均<0.05，差异均有统计学意义 。两组在肺转移率（P＝0.001）和累及其他脏器个数（P＝0.041）的比较，差异均具有统计学意义。 结论  HCCLM3细胞制作的人肝癌裸鼠转移模型具有高转移潜能，可应用于人肝癌的生物性状的研究。

【关键词】  癌，肝细胞； 模型，动物；　肿瘤转移；　对比研究

Comparison of the metastatic characteristics of HCCLM3 cells and SMCC-7721 cells in nude mice model    LI Jing-dong, PENG Yong, DAI Yi, LI Bo, WEI Yong-gang, YAN L-nan. Department of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Sichuan Nanchong 637000, China

Corresponding author: LI Bo, Email: ljdxl_05@ hotmail.com

【Abstract】    Objective    To compare the metastatic characteristics of HCCLM3 cells and SMCC-7721 cells in nude mice model. Methods    Nude mice were divided into two groups (n = 8, each), mice were transplanted with HCCLM3 cells (group A) and SMMC-7721 cells (group B). Tumor size, metastasis rate and other clinical parameters were compared between the two groups. Statistical analysis was performed with the help of SPSS 16.0 for Windows computer software (SPSS, Inc., Chicago, IL). P values of less than 0.05 were considered statistically significant. Results    Intrahepatic metastases rate was 100% (8 / 8), mean intrahepatic primary tumor volume was (6954±1945) mm3 in group A, Intrahepatic metastases rate was 62.5% (5/8), and mean intrahepatic primary tumor volume was (6034±2035) mm3 in the group B. There was no statistical difference in the primary liver tumor size and intrahepatic metastases rate (P = 0.20; t = 6.38, P = 0.37, respectively). The numbers of intrahepatic metastases and the involved lobes, and the volume of tumor were 4.5 (median), 3, and 975 mm3 (median) respectively, in group A, and these were 1 (median), 1 and 274mm3 (median) respectively in group B. The difference between two groups was statistically significant (Z values, -2.818, -2.289, and -1.975, repectively).The rate of lung metastasis and other organ metastasis in the A group was significantly higher than that in group B (P < 0.001, P < 0.041, respectively). Conclusion    HCCLM3 cells have higher metastatic potential than SMMC-7721 cells in nude mice.

【Key words】Carcinoma, hepatocellular; Models, animal; Neoplasm metastasis; Comparative study 

建立稳定的自发性转移人肝癌动物移植模型一直是人们进行肝癌基础研究的重要内容之一。我们从上海复旦大学肝癌研究所引进的高转移人肝细胞癌细胞系HCCLM3进行培养，并借鉴了国内外的一些建立肝癌动物模型的经验，应用HCCLM3细胞和SMMC-7721细胞构建人肝癌裸鼠间接原位移植模型，并对它们的转移性状进行了比较。

材料与方法

一、主要试剂和材料

1. 细胞株和裸鼠：HCCLM3购自上海复旦大学肝癌研究所建立的高转移人肝细胞癌细胞系。SMMC-7721细胞株由四川大学华西医院移植免疫实验室传代培养。裸鼠（BALB/C-nu/nu）：雌雄不分，4～6周龄，体质量15～20g，购自四川大学华西实验动物中心，在恒温（25℃～27℃）、恒湿（45%～50%）、新鲜空气、高度除尘除菌、无特殊病原体环境下饲养。实验分为两组：应用HCCLM3细胞构建的人肝癌裸鼠模型组为A组，SMMC-7721细胞构建的模型组为B组，每组8只。

2. 主要试剂：胎牛血清，购自美国HyClone公司；RMPI 1640培养液，购自美国Sigma公司。

二、实验方法

（一）人肝癌细胞系HCCLM3和SMMC-7721的培养

1. HCCLM3细胞的培养：培养条件是37℃、5% CO2、饱和湿度。细胞消化液为0.25%胰酶（含0.02%的乙二胺四乙酸）。(1) 过渡培养：收到邮寄的HCCLM3细胞后，立即用1号培养液培养3d，用2号培养液培养4d，依此类推，一直培养1个月后逐渐过渡到RMPI 1640培养液。（2）换液：细胞培养于培养瓶中，加5～6ml培养液，隔日1次更换培养液。每次换液前将培养液在37℃水浴预热15min。培养4～5d或适时传代1次。

2．常规培养HCCLM3细胞和SMMC-7721细胞。

3. 用胰酶消化肿瘤细胞制成细胞悬液计数，分别加入24孔板，每个孔含有4×104个细胞。每天用胰酶消化孔内细胞，计数活细胞，每板计数2孔，取平均位，共计数7次（1次/d），根据细胞增殖速度作生长曲线。细胞倍增时间按照Patterson公式[1]计算：TD=T lg2/lg（N/N0）（TD：倍增时间，T：时间间隔。N0：起点细胞数，N：终点细胞数）。

(二) 裸鼠的人肝癌高转移模型的制作

1. 建立皮下荷瘤通道：取对数生长期HCCLM3细胞或SMMC-7721细胞分别制成单细胞悬液。锥虫蓝染色显示活细胞比率在98%以上。调整细胞浓度仍为107个/ml的细胞悬液0.2ml，分别接种于1只裸鼠（4周龄）右侧腋下。

2. 间接原位移植荷瘤：裸鼠于接种后第15天左右开始成瘤，第35天后肿瘤生长到直径约1.7cm大小时，处死裸鼠，剥离瘤体，切成直径约1mm左右，原位移植于8只裸鼠的左肝外叶。原位移植荷瘤的方法：用硫酸戊巴比妥钠（0.6%）腹腔注射法麻醉裸小鼠，剂量40～50mg/kg。待麻醉起效后，取仰卧位，并用无菌手术薄膜固定裸鼠四肢于无菌台上，皮肤用75%乙醇消毒2次，铺无菌孔巾。均取左肋缘下切口，长1～2cm，分层切开腹壁，进入腹腔，用刀柄按下切口下缘，上缘轻轻施压，肝左叶即挤出腹腔，用眼科镊在肝包膜下轻轻戳一隧道，等渗盐水纱布按压片刻止血，将备好的肿瘤组织块塞入，8-0丝线在肝脏表面做8字缝合，固定植入瘤组织。将肝脏返回腹腔，5-0的无损伤缝线间断缝合关腹。术后常规无菌饲养。整个手术操作在无菌超净台，麻醉苏醒后送回笼内无菌饲养。术后不用抗生素，自由进食。术后21d全麻后切取肝脏、肺组织及可疑转移的淋巴结和其他器官。

(三)、组织病理学检查

1. 固定包埋切片：将移植瘤、转移瘤、可疑淋巴结以及可疑转移的各个器官浸泡在4%的中性甲醛溶液中固定过夜。切除肝肿瘤、癌旁肝组织和双肺，均用4%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，每个蜡块间隔50μm，连续切取5μm厚切片10张，双侧肺共20张，记录20张切片转移灶的总数。

2. 肝、肺均做常规苏木素-伊红（HE）染色，HE染色后，镜下肺转移灶的分级和计数：Ⅰ级为肿瘤细胞数小于20个；Ⅱ级为肿瘤细胞数20～50个；Ⅲ级为肿瘤细胞数50～100个；Ⅳ级为肿瘤数大于100个，巨大的转移灶的计数按照Ⅳ级转移灶的倍数来计算(巨大转移灶所含肿瘤细胞数目除以100得到Ⅳ级转移灶的倍数)。每隔2个切面计数一次肺转移灶。镜下肺转移灶的总数的计数方法[2]：总转移灶=Ⅰ级(细胞团数)×1+Ⅱ级级×2+Ⅲ级×3+Ⅳ级×4。

三、统计学处理

所有数据由SPSS16.0软件分析，计量资料采用t检验，率的比较采用Fisher确切概率法，计数资料采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。检验水准α＝0.05，双侧检验。

结    果

一、两组裸鼠肝原发灶、转移灶的大体和病理学检查结果比较

1. 两组裸鼠肝内原发肿瘤体积比较：HCCLM3细胞构建的人肝癌裸鼠高转移模型组的肝内原发肿瘤体积为（6954±1945）mm3，SMMC－7721细胞构建的裸鼠人肝癌模型组的肿瘤体积（6034±2035）mm3，两组比较，差异无统计学意义。

2. 两组裸鼠肝内局部转移情况: 两组肝内转移率比较差异无统计学意义。肝内转移的数目和累及肝叶数以及转移肿瘤的体积大小，两组比较，差异均有统计学意义，见表1（略）。

二、肝外远处转移灶的大体和病理检查的比较

1. 肺转移、其他远处转移累及的器官和转移灶的数量：A组的肺转移率、肺转移结节数和远处脏器的转移数明显高于B组，两组比较, 差异均有统计学意义，见表2（略 ）。

b：因B组仅有1例出现肺转移，故无法对两组的肺转移结节数行统计学比较，但A组的肺转移结节数明显多于B组

2. 肺转移灶的病理学检查:高转移肝癌模型组的肺转移灶数目、转移灶大小明显高于SMMC-7721构建的肝癌模型组,见图3，4。

讨    论

包括肝癌在内的任何肿瘤，在其演化过程中，由于瘤细胞的遗传型的不稳定性，加上宿主和其他环境的压力，造成了细胞不断变异，产生了分化和表型的多样性。一个实体瘤组织内或细胞系是由生物学性状不同的瘤细胞克隆组成的，这就是肿瘤的异质性。同样，肿瘤在转移性状方面也存在异质性。在一个原发瘤细胞群体中，并非所有瘤细胞均具有侵袭和转移的能力，仅某些特殊亚群才具有转移潜能，产生转移。而且即使在同样有转移潜能的肿瘤细胞亚群中，它们各自的转移潜能也并不一致[3]。如能分离出不同转移潜能的细胞亚群，然后再分别将其间接原位移植于裸鼠的肝脏上，比较它们的转移性状，分析黏附分子、细胞外基质、血管生成因子、信号传导等在高转移与低转移模型中表达的差异，这将有助于对肝癌高转移的分子机制的认识，也可对进一步预测肝癌的微转移和设计对肝癌的干预治疗提供线索。因此，我们借鉴了国内外的一些建立肝癌动物模型的经验[4-5]，应用HCCLM3细胞和SMMC-7721细胞构建人肝癌裸鼠间接原位移植模型。

我们的研究结果显示，人肝癌裸鼠高转移模型组肝内转移率为100%，SMMC-7721构建的裸鼠肝癌模型组的肝内转移率也高达62.5%，这从另一个角度说明肿瘤异质性的存在，提示在研究肿瘤转移的分子机制时，最好从一个肿瘤细胞群体中分离出转移力最强和转移力最弱的两组，然后进行比较；最好用转移力强的与不转移的细胞亚群来作比较，也许更能说明问题。两组肝癌模型的肝内转移率差异无统计学意义，但肝内转移的数目和累及肝叶数以及转移肿瘤的体积大小，两组相比差异均有统计学意义，说明对转移的比较不仅要从转移的阳性率来分析，还应从转移灶的数目、结节的大小、累及的肝叶数全面进行，才可能得到比较客观的结果，人裸鼠肝癌高转移模型的肝内转移率明显高于普通肝癌动物模型。

梅英等[6]报道肿瘤组织移植于肝脏被膜下后即可在肝内生长，逐步向肝内其他部位转移，还可侵犯至肝周脏器，并在腹腔内广泛种植。但我们在解剖两种肝癌裸鼠模型的腹腔时发现原发灶肿瘤体积大小差异无统计学意义，分析其原因可能有以下几种情况：（1）不同肿瘤细胞亚群的细胞在肝被膜下生长速度不一样；（2）尽管将HCCLM3和SMMC-7721细胞注入裸鼠皮下的剂量完全一致（均为5×106个），但在将转入肝包膜下的组织块，难以完全一致。肝癌移植瘤包膜不完整，表面常有点状出血，切面呈暗红色，质极脆，直径在1cm以上的癌结节均有中心的坏死和出血。从HE染色来看，高转移模型组镜下有大片癌巢形成，肿瘤细胞异形性极其明显，病理核分裂象多见，核仁较大，深染，且在几个癌巢之间有很多的假小叶形成，肿瘤侵犯周围邻近组织如膈肌。而SMMC-7721构建的裸鼠肝癌模型尽管出现肝内转移且阳性率也较高，但癌巢较小，常单发，与人肝癌裸鼠的高转移模型组裸鼠常多发明显不同。

人肝癌中裸鼠高转移动物模型除了肝内转移外，还个有突出的有肝外转移的特性。常累及肝门、及髂动脉旁，并可侵犯胃肠道、肠系膜、网膜、膈肌和腹壁。将其与SMMC-7721构建的人肝癌中裸鼠模型比较，两者的肺转移率及肺上转移灶结节的个数比较，差异均有统计学意义，且两者在肺转移灶的分级情况也明显不同。

因此，我们认为HCCLM3细胞制作的人肝癌裸鼠转移模型具有高转移潜能，可应用于人的肝癌的生物性状的研究。

参  考  文  献

[1]Li Y, Tang Y, Ye L, et al. Establishment of a hepatocellular carcinoma cell line with unique metastatic characteristics through in vivo selection and screening for metastasis-related genes through cDNA microarray. J Cancer Res Clin Oncol, 2003, 129: 43-51.

[2]Li Y, Tang ZY, Ye SL, et al. Establishment of human hepatocellular carcinoma cell line with spontaneous pulmonary metastasis through in vivo selection. Zhonghua Yixue Zazhi, 2002, 82: 601-605. (in Chinese)

李雁,汤钊猷,叶胜龙,等.体内连续筛选法建立自发性肺转移人肝癌细胞系.中华医学杂志,2002，82:601-605.

[3]Li Y, Tang ZY, Ye SL, et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World J Gastroenterol, 2001, 7: 630-636.

[4]Yang J, Qin LX, Li Y, et al. Molecular cytogenetic characteristics of the human hepatocellular carcinoma cell line HCCLM3 with high metastatic potential: comparative genomic hybridization and multiplex fluorescence in situ hybridization. Cancer Genet Cytogenet, 2005, 158: 180-183.

[5]Lou CY, Feng YM, Qian AR, et al. Establishment and characterization of human hepatocellular carcinoma cell line FHCC-98. World J Gastroenterol, 2004, 10: 1462-1465.

[6]Mei Y, Shi YJ, Ding X, et al. Reversal of adriamycin resistance of hepatocellular carcinoma by targeting it with recombined adenovirus carrying antisense multidrug resistance gene 1 RNA. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2007, 15: 199-203. (in Chinese)

梅英,石毓君,丁雄,等.携多药耐药基因1反义RNA重组腺病毒逆转肝癌多药耐药细胞的实验研究.中华肝脏病杂志,2007,15: 199-203.

中华肝脏病杂志版权