高脂饮食诱导幼鼠脂肪肝模型的建立及其相关代谢研究

【摘要】  目的  通过高脂饮食诱导幼龄大鼠建立非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型。 方法  3周龄刚离乳SD大鼠30只，雌雄各半，随机分为正常(N)组、20%高脂饮食组（HF1组）、30%高脂饮食组(HF2组)。无特定病原环境下饲养6周，第6周末处死大鼠，分别进行如下检测：（1）身长、体质量、肝脏质量测量，计算肝指数；（2）采血测空腹ALT、AST、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、胰岛素、血糖水平，计算HOMA胰岛素抵抗指数；（3）肝组织匀浆，检测肝脏TG水平；（4）肝组织切片苏木素-伊红染色观察肝组织病理形态，油红O染色显示脂质沉积；（5）免疫组织化学EnVision法染色，显示肝组织固醇调节元件结合蛋白-1、瘦素的表达。组间均数比较采用One-way ANOVA、两两比较采用LSD方法进行统计学分析。 结果  病理结果显示模型组大鼠肝脏符合典型的NAFLD病理特征，HF2组内各标本脂肪变性程度较均匀，无动物死亡现象发生；与N组相比，HF2组血清TC显著升高［（2.50±0.39）mmol/L对比（1.82±0.43）mmol/L，P<0.01］, 肝脏TG含量显著升高［（25.38±13.29）mmol/L对比（12.09±9.59）mmol/L，P<0.01］，血清ALT显著升高[（69.80±18.22）U/L对比（48.00±10.45）U/L，P<0.01］；与N组相比，HF1组血清TG显著下降［（0.17±0.10）mmol/L对比（0.32±0.12）mmol/L，P<0.05］；血糖水平显著升高［（12.33±3.48）mmol/L对比（8.13±2.53）mmol/L，P<0.05］；各组血清AST、胰岛素、及HOMA胰岛素抵抗指数差异无统计学意义；模型组肝组织固醇调节元件结合蛋白-1、瘦素表达增加。 结论  30%高脂饲料饲养6周，可以诱导幼龄大鼠建立NAFLD模型，高脂饮食导致幼鼠肝脏固醇调节元件结合蛋白-1表达增加，脂肪合成增加，瘦素表达增加。

【关键词】  脂肪肝，非酒精性； 大鼠； 模型, 动物； 代谢

Metabolic characteristics of a fatty liver disease model induced by high-fat feeding in young rats   SU Hui-min, ZHANG Zhi-xin, PAN Lin, GUO Yan-ru, LIU Ying-ke, ZHANG Qiong. Department of Pediatrics, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China

Corresponding author: ZHANG Zhi-xin, Email: zhangxhixin032@ 163.com

【Abstract】    Objective    To establish nonalchoholic fatty liver disease (NAFLD) in young rats, and to investigate the metabolic characteristics of these rats. Methods    Fifteen male and fifteen female SD rats of 3 weeks old were randomly divided into three groups, normal group (N), 20% high fat group (HF1) and 30% high fat group (HF2). All the rats were fed under Specefic pathogen Free (SPF) condition for 6 weeks and executed at the end of the 6th week. Body length and weight of each rat as well as their liver weight were measured for calculating Liver Index (LI). ALT, AST, TG, TC, INS, Glu and HOMA-IR in the blood were mearsured. Liver tissue homogenate was prepared for detecting TG level. The liver section was stained with HE and oil red. The expression of SPEBP-1 and leptin in liver was detected by immunostaining. Results    The typical pathological change of NAFLD was found in the rats of HF groups. In HF2 group, no rats died during the experiment and the degree of fat degeneration is homogeneous. Comparing with those in N group, TC (mmol/L),  liver TG (mmol/L) and ALT levels in HF2 group were significantly elevated (2.50±0.39 vs 1.82±0.43, P < 0.01; 25.38±13.29 vs 12.09±9.59, P < 0.01 and 69.80±18.22 vs 48.00±10.45, P < 0.01, respectively). Comparing with those in N group, TG level in HF1 group was significantly decreased (0.17±0.10 vs 0.32±0.12, P < 0.05), Glu level in HF1 group was significantly elevated (12.33±3.48 vs 8.13±2.53, P < 0.05). There were no significant difference between the results of AST, INS and HOMA-IR among the groups. The expression level of SREBP-1 and leptin increased in HF groups. Conclusion   NAFLD can be induced by 30% high-fat feeding for 6 weeks in young rats, high-fat feeding induces the expression of SREBP-1 and leptin expression and fat synthesis.

【Key words】    Fatty liver, nonalcoholic; Rat; Animal model; Metabolism

有报道，我国儿童脂肪肝的患病率在2%～4%[1]，其中多数系饮食结构不合理导致的非酒精性脂肪肝病（NAFLD）。儿童NAFLD进展为肝硬化的病例也已有报道，年龄最小的仅9岁[2]。随着对代谢综合征研究的深入，儿童NAFLD的防治已受到重视，儿童肝脏脂肪变性可能是代谢综合征的一个核心特征[3]。但缺少幼龄NAFLD动物模型在一定程度上限制了儿童NAFLD发病机制及药物应用的研究。有学者给予幼鼠灌喂高脂、高热量脂肪乳，4周造出非酒精性脂肪肝炎（NASH）模型[4]，但其所用脂肪乳需每日灌胃，繁琐耗时，且容易因操作不当导致动物死亡。本研究选择幼龄大鼠作为研究对象，探寻更易操作的幼鼠NAFLD造模方法，了解胰岛素（insulin，INS）敏感性、瘦素在幼龄大鼠NAFLD形成中的变化。

材料与方法

一、实验动物及材料

21日龄SD大鼠，体质量（45.07±4.74）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；大鼠饲料、猪油购自中国医学科学院实验动物中心。INS检测试剂盒、固醇调节元件结合蛋白-1（sterol regulatory element-binding protein 1,SREBP-1）及瘦素免疫组织化学试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色剂分别购自美国Linco公司、Santa公司、Dako公司、Sigma公司。

二、方法

1．幼鼠NAFLD模型的建立：30只21日龄SD大鼠，雌雄各半，适应性饲养1d后，随机分为正常组、20%高脂饮食组（HF1组）、30%高脂饮食组（HF2组)，每组10只。正常组予以普通饲料作为对照，普通饲料热量约3000kcal/kg（1kcal＝4.184kJ）；HF1、HF2组分别予以热量约4280kcal/kg、4870kcal/kg高脂固体饲料（普通大鼠饲料中添加20%、30%猪油）。

2．空腹血清ALT、AST、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、INS、血糖水平测定，计算HOMA胰岛素抵抗指数（insulin resistance index，HOMA-IR）：大鼠禁食24h后10%水合氯醛麻醉，取血分离血清，ALT、AST、TG、TC、血糖由日立7170自动生化分析仪同批测定。INS采用放射免疫分析方法测定。HOMA-IR＝空腹胰岛素×空腹血糖/22.5。

3．肝指数计算：称取体质量及湿肝脏质量，肝指数＝（肝脏质量/体质量）×100%。

4. 肝组织TG测定：组织TG测定参照Folch等[5]的方法，将肝组织研磨，用2∶1的氯仿-甲醇混合液进行组织匀浆脂质萃取。萃取物蒸发后异丙醇复溶，应用日立7170自动生化分析仪同批测定。

5．观察肝脏病理形态变化：处死大鼠后，迅速取出肝脏称质量，统一取新鲜肝右叶约1.5cm×1.5cm×0.5cm大小的组织块固定于10%中性甲醛溶液中，进行脱水、透明、浸蜡、包埋、制片、苏木素-伊红（HE）染色，观察肝组织光镜下病理改变，组织病理学诊断参照2006年《非酒精性脂肪肝病的诊断与治疗指南》[6]，依据肝细胞脂肪变性占据所获取肝组织标本量的范围，分为：F0，<5%肝细胞脂肪变；F1，5%～30%肝细胞脂肪变；F2，31%～50%肝细胞脂肪变；F3，51%～75%肝细胞脂肪变；F4，75%以上肝细胞脂肪变。根据炎症程度，分为：G0，无炎症；G1，腺泡3带呈现少数气球样肝细胞，腺泡内散在个别点灶状坏死；G2，腺泡3带明显气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死增多，门管区轻至中度炎症；G3，腺泡3带广泛的气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死明显，门管区轻至中度炎症和（或）门管区周围炎症。另取新鲜肝组织冰冻切片，油红O染色观察肝细胞脂肪变性的程度，肝细胞质中脂质沉积出现红色颗粒为阳性。

6. 免疫组织化学染色检测肝脏SREBP-1、瘦素：肝脏组织包埋、切片、脱蜡；0.3% H2O2氧化15min；0.01mol/L磷酸盐缓冲液洗5min×3次；分别滴加1∶200 SREBP-1和1∶200瘦素；ER1抗体，4℃过夜（同步设置对照）；0.01mol/L磷酸盐缓冲液洗5min×3次；滴加第二抗体，室温2h；0.01mol/L磷酸盐缓冲液洗5min×3次；用二氨基联苯胺显色4min；Meyer苏木素复染细胞核1min，流水冲洗10min；梯度乙醇脱水；二甲苯透明；中性树胶封片。

三、统计学处理

应用SPSS12.0.1统计分析软件处理实验数据，所得数据符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x-±s）表示，非正态分布的变量数据经对数转换后使之正态化后再进行分析，组间均数比较采用One-way ANOVA,两两比较采用LSD方法。统计学显著性检验水准α=0.05(双侧)。

结    果

1. 高脂饮食对大鼠一般状态的影响：实验期间，各模型组大鼠食欲不同程度减低，各模型组每日平均进食热量均高于正常组，各组大鼠平均每只每天进食量、热量变化见图1。实验前,各组大鼠间体质量无差异，实验期间，各模型组体质量增长缓慢（图2），毛发稍蓬松，毛色变暗。实验结束后，各模型组体质量显著低于正常组（P<0.01），HF1组最终体长低于正常组（P<0.05），HF2组最终体长显著低于正常组（P<0.01），见表1。

2. 高脂饮食对大鼠肝脏质量及肝脏指数的影响：与正常组相比,各模型组肝脏质量明显小于正常组（P<0.01）。但各组肝指数无明显统计学差异（表1）。

3. 高脂饮食对大鼠血清ALT、AST、TG、TC、血糖、INS、肝组织TG及HOMA-IR的影响：与正常组相比,HF2组血清TC显著升高（P<0.01）,HF1组与正常组相比无明显差异；HF1组血清TG含量较正常组显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）；HF2肝组织TG含量较正常组显著升高（P<0.01)；HF1组血糖水平较正常组显著升高（P<0.05）；HF2组ALT水平较其他组显著升高（P<0.05），各组AST、INS水平及HOMA-IR无显著差异，见表1。

4. 肝组织病理学改变：正常组肝脏外观呈红褐色，柔软富有弹性；肉眼观察，各模型组间差别不明显，色泽较暗，质地、弹性较正常组差，个别肝脏体积增大，边缘钝而厚，表面及切面呈灰黄色，有油腻感。HE染色：正常肝组织肝细胞索以肝小叶中央静脉为中心，呈放射样排列（图3A），各模型组呈现肝细胞脂肪变性，脂肪变肝细胞体积增大，胞质内可见数量不等、大小不一的脂肪空泡，胞核被推向周边，汇管区炎症细胞浸润，且出现点、灶状坏死（图3B）。油红O染色显示正常肝组织几乎无着色（图4A），HF2组脂肪变肝细胞呈鲜红色（图4B），HF1组脂肪变程度较HF2组轻（图4C）。各组间病理组织学比较显示HF2组的脂肪变性及炎症较HF1组严重（表2）。

5. 肝组织SREBP-1、瘦素的表达：正常组肝组织SREBP-1、瘦素低表达，模型组肝组织SREBP-1、瘦素表达增强（图5）

讨    论

随着儿童代谢综合征发病率的增加，NAFLD成为儿童常见的肝脏损害。目前，临床对于本病的治疗主要依靠饮食、运动调节，尚无公认安全有效的药物治疗方案。然而，现行方案依从性低，对中度以上的NAFLD患儿疗效较差，由于儿童处于生长发育的特殊时期，用药安全性问题成为遴选儿童脂肪肝治疗药物的瓶颈，而儿童NAFLD动物模型的建立成为该方面研究的重要问题，缺乏可靠的幼鼠动物模型,影响了儿童NAFLD发病机制及治疗的研究。有报道，给予幼兔高脂饲料饲养8周可建立幼兔NASH模型[7]，但兔系食草动物，饮食结构与人类相差较远，与人类的同源性较差。给予高脂饮食诱导的成年大鼠NAFLD模型，接近人类发病情况且容易建立,但是大鼠青春期短, 3周龄离乳，8周龄发育基本成熟[8]，10周龄进入适宜的繁殖期，因此，短暂的造模时间是幼年大鼠NAFLD模型建立的难点，目前国内鲜见幼年大鼠NAFLD模型建立方法的相关报道。国外学者Raso等[4]报道给予幼鼠灌喂高脂、高热量脂肪乳，4周造出NASH模型, 幼鼠肝组织丙二醛、硝基酪氨酸蛋白、肿瘤坏死因子α、过氧化物酶体增生物激活受体γ表达增加，过氧化物酶体增生物激活受体α表达下降，基质金属蛋白酶活性增强，表明高脂饮食导致幼鼠肝脏出现炎症、脂质过氧化，但其所用脂肪乳需每日灌胃，繁琐耗时，且容易因操作不当导致动物死亡。此外，该研究侧重于NAFLD幼鼠的肝脏炎症、脂质过氧化研究，关于NAFLD幼鼠INS敏感性状况、瘦素表达变化，目前鲜见报道。

本研究结果显示30%高脂组各标本HE染色光镜下，均存在不同程度的肝细胞脂肪变性、炎症细胞浸润；油红O染色阳性，符合典型的NAFLD病理特征。该组各标本间脂肪变性程度较均匀，造模方法简单，无动物死亡现象发生；该条件下多数实验指标可较好反映儿童NAFLD的临床特点，且模型多数为中度以上脂肪肝，有利于进行药物疗效观察，是理想的造模方法。

本研究结果还显示,HF2组血清ALT水平较正常组显著上升，HF1组亦有上升趋势，但各组AST水平无明显差异，可能与造模时间短有关；扩大样本量，提高脂肪含量，可能有助于扩大差异。血清TC、TG及肝组织TG检测结果显示,高脂喂养可以导致脂代谢紊乱，组织TG水平与病理结果相符，较血脂更好反映幼鼠肝脏脂肪变的严重程度。上述检测结果提示，幼龄NAFLD大鼠脂代谢紊乱出现在肝功能损害之前，同时也提示血清转氨酶及血脂检测,仅能部分反映肝脏的脂肪变程度，这符合儿童NAFLD的临床特点，即仅有影像学脂肪肝表现，而转氨酶、血脂正常或轻度升高。提示儿童NAFLD可能是儿童代谢综合征的早期受累器官，病变出现较早。SREBP-1是脂肪合成基因的重要转录调节因子，它通过调节脂肪代谢相关酶的基因表达来调控体内的脂肪合成。本研究结果显示模型组SREBP-1表达阳性，推测可能为高脂喂养导致SREBP-1表达增加，引起其调控的成脂基因过度表达，脂肪酸合成增多,肝脏脂质代谢障碍,导致NAFLD发生。瘦素是重要的脂肪细胞因子[9-10]。通过对成年NASH大鼠的研究也发现，瘦素功能缺失是大鼠NASH形成的主要决定因素[11]，并且可能参与肝组织纤维化的形成[12]。我们通过免疫组织化学染色法，检测到幼鼠肝组织瘦素表达增加，提示可能因高脂饮食导致机体产生保护性反应。INS抵抗是代谢综合征的中心环节，在代谢性疾病中具有重要地位，临床上发现，NAFLD儿童存在INS抵抗[13]。但本研究中各组HOMA-IR间差异无统计学意义，可能与本实验模型大鼠疾病形成时间短有关。评价INS敏感性的金标准是“正常血糖-高胰岛素钳夹术”，通过计算HOMA-IR，评价INS敏感性简便、快捷、经济，但精确性较钳夹术差，可能难以精确反映低样本量、早期NAFLD大鼠机体的INS敏感性状况。

高脂饮食导致体质量超标和肥胖是儿童NAFLD最常见的危险因素,据报道，肥胖儿童NAFLD的患病率为20%～24%。但本研究中我们发现，虽然实验组饮食热卡高于对照组，但高脂饲养的幼鼠6周内体质量增长缓慢,最终体质量小于正常组，差异有统计学意义。与Raso等[4]报道的结果相反，可能与下列因素相关：（1）高脂饲料的质量及摄食方式：使用脂肪乳灌胃可能比固态饲料自由取食，较易保证每日进食量；选用的鼠粮质量，特别是蛋白质的质量问题，但由于试验方法问题，我们未对蛋白质含量进行进一步精细分析。（2）可能与瘦素表达增加，抑制脂肪合成，减少体脂相关。（3）高脂饲养可能已破坏幼鼠尚未成熟的胃肠道功能。

综上，本研究成功建立了幼鼠NAFLD模型,为今后研究儿童NAFLD提供了可参照的实验模型，并对幼鼠NAFLD的代谢改变提供了部分实验数据。

志谢    北京大学心血管研究所汪南平教授对本文给予指导

参  考  文  献

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