miRNA沉默缺氧诱导因子1α基因对HepG2细胞增殖的抑制作用

【摘要】  目的  探讨以miRNA沉默缺氧诱导因子1α（HIF-1α）基因，观察其对肝癌细胞株（HepG2细胞）增殖的抑制作用。 方法  构建靶向HIF-1α基因miRNA干扰载体，转染HepG2细胞，以定量PCR和Western blot分析靶基因和蛋白的表达；构建含缺氧反应元件双荧光素酶报告基因检测转染后相对光单位值；酶联免疫吸附法定量检测血管内皮生长因子和血管生成素2的表达；细胞凋亡及增殖周期以流式细胞仪和膜联蛋白/碘化丙啶（V-FITC/PI）双重染色法分析。采用t检验和两因素方差分析及q或q’检验分析计量资料。 结果  HepG2细胞在转染HIF-1αmiRNA后72h，HIF-1α在转录和翻译水平上分别下降87%和56%，双荧光素酶报告基因减少46%，血管内皮生长因子和血管生成素2分别减少54%和36%;癌细胞凋亡率为22.46%±0.61%（P<0.01），G1和S期比例分别为61.49%±1.12%和22.40%±0.58%；联合阿霉素处理后，凋亡率增至36.99%±0.88%，G1、S期比例分别为65.68%± 0.91%和19.47%±1.34%。 结论  HIF-1αmiRNA可抑制HIF-1α基因表达，联合阿霉素有效调控肝癌细胞周期，促进凋亡、抑制增殖。

【关键词】  癌, 肝细胞； 细胞凋亡； 缺氧诱导因子1，α亚基； RNA, 小分子干扰； HepG2细胞

Inhibitory effect of miRNA silencing hypoxia-inducible factor alpha subunit gene on the proliferation of HepG2 cells    DONG Zhi-zhen*, YAO Deng-fu, LI Shan-shan, YAO Min, YU Dan-dan, YAO Ning-hua, QIAN Ya-jie, QIU Li-wei. *Department of Diagnostics, Medical School of Nantong University, Nantong Jiangsu Province 226001, China

Corresponding author: YAO Deng-fu, Email: yaodf@ahnmc.com, Clinical Medicine Research Center, Affiliated Hospital, Nantong University, Nantong Jiangsu Province 226001, China

【Abstract】    Objective    To investigate the effect of miRNA silencing HIF-1α gene on the proliferation of HepG2 cells. Methods    The eukaryotic expression plasmids of HIF-1α miRNA and report gene containing hypoxia-reponse element were constructed and trasnfected into HepG2 cells. The expressions of HIF-1α gene and protein were determined by real time-PCR and Western blotting. The expressions of HIF-1α, vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietin-2 (Ang-2) were quantitatively detected by ELISA. The alterations of cell cycles and apoptosis rate were quantitatively measured by flow cytometry and Annexin V-FITC/PI double dyeing assay. Results    72 h after transfection the downregulations of HIF-1α mRNA and protein were 87% and 56% respectively, and the decrease of target gene was 46% in the report gene, 54% in VEGF and 36% in Ang-2, respectively. The apoptotic ratio of HepG2 cells was 22.46±0.61% (P < 0.01). The cell cycle changed greatly at the ratio of G1 (61.49±1.12%) and S (22.40±0.58%, P < 0.01). After being combined with doxorubicin, the apoptotic ratio increased to 36.99±0.88% and the ratios of G1 and S phases were upregulated to 65.68±0.91% and 19.47±1.34% respectively. Conclusion    HIF-1α miRNA or / and doxorubicin can regulate the growth cycles of HepG2 cells, promote the cell apoptotosis and inhibit the cell proliferation.

【Key words】     Carcinoma, hepatocelullar;     Apoptosis;     Hypoxia-inducible factor, alpha subunit;    RNA, small interfering;    HepG2 cell lines

缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor alpha subunit, HIF-1α）是介导生理性和病理性低氧反应的关键转录因子，在缺氧环境中显著表达，进入细胞核与HIF-β异二聚体化，与下游百余种靶基因的缺氧反应元件（hypoxia-response element, HRE）结合，发挥系列细胞适应性调节，促进血管新生、癌细胞增殖或转移，使肝癌（HCC）细胞耐受放、化疗、抑制凋亡和分化[1-3]。我们以靶向HIF-1α基因的miRNA技术干扰HepG2细胞中HIF-1α表达，观察下游靶基因血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素2（angiopoietin，Ang-2）变化，以及联合阿霉素处理对肝癌细胞株HepG2细胞凋亡和周期时相的影响，观察沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响。

材料与方法

1. 材料：人HepG2细胞株、RPMI 1640培养液购自南京凯基公司；鼠抗人HIF-1α单克隆抗体购自英国Abcam公司;双荧光素酶报告基因、pGL3及pRL-TK购自美国Promega公司；Annexin-VFITC凋亡检测试剂盒和FuGENE HD转染试剂购自德国Roche公司；Premix Taq酶、Xho-Ⅰ、Hind-Ⅲ及SYBR Premix ExTaq购自日本TaKaRa公司；RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒购自立陶宛Fermentas公司；VEGF、Ang-2酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自美国R&D公司；pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR载体、载体构建盒BLOCK-iTTM含EmGFP的PolⅡmiR RNAi表达载体购自美国Invitrogen公司；DYEnamic ET Dye测序由美国Amersham Biosciences公司完成。Top10感受态细胞购自百奥生物公司；鼠抗人β-肌动蛋白第一抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠第二抗体、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶、彩色预染蛋白标准品等购自杭州碧云天公司。

2. 引物设计、cDNA合成和PCR扩增：根据HIF-1α序列（NM_001530），以Premier Primer 5.0设计引物。外部HIF-1α-P1：5′-ATACTCAAA GTCGGACAGC-3′（nt2386～2404）和HIF-1α-P2: 5′-TTCACCCTGCAGTAGGTTTC-3′(nt2833～2852)，长度为467bp；内部HIF-1α-P3：5′-CTCATCCAAGAAGCCCTAAC-3′(nt 2452～2471)和HIF-1α-P4：5′-TCATAACTGGTCAGCT GTGG-3′(nt2781～2800)，终产物为349bp。总RNA 4μg，随机引物，RiboLockTM核酸酶抑制物，dNTP Mix，RevertAidTM M-MuLV逆转录酶合成HIF-1α- cDNA后以巢式PCR扩增，94℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 60s，重复35个循环。

3. PCR产物测序分析：紫外透射仪下留取目的DNA凝胶，以MontageTM DNA装置提取DNA，加1μg DNA以DYEnamic ET Dye测序试剂，以MegaBACE DNA测序仪测序，MegaBACE系统软件（Version 3.0）分析，与源序列比较。

4. 细胞培养及分组：HepG2细胞常规复苏，RPMI 1640完培培养。设空白、阴性、干扰组，检测细胞凋亡及周期变化;另加阿霉素组和干扰联合阿霉素组，每组均设3个复孔。空白组常规培养；阴性组添加阴性质粒和转染试剂培养；干扰组加HIF-1α干扰载体和转染试剂培养。于转染24、48、72h收集细胞。

5. miRNA设计及合成：按GenBank人HIF-1α mRNA序列(NM_001530)，用Invitrogen miRNA软件设计4对miRNA寡聚单链DNA，各自退火成双链。以BLOCK-iTTMPol Ⅱ miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP（购自美国Invitrogen公司）重组克隆，将双链miRNA oligo插入到miRNA载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中，构建质粒，筛选干扰效率最好的一对序列为5′-TGCTGTAAAGCATCAGGTTCCTTCTTGTTTT GGCCACTGACTGACAAGAAGGACTGATGCT TTA-3′和5′-CCTGTAAAGCATCAGTCCTTC TTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAAGAAGGAAC CTGATGCTTTAC-3′用于本研究，其中划线部分为靶区序列，上下游为茎环结构。

6. 缺氧反应元件（HRE）-pGL3的构建：设计合成HRE序列，HRE-F为5′-TCGAGCCACAGT GCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCCCT CCCATGCA-3′和HRE-R为5′-AGCTTTGCAT GGGAGGGAAGAGGACCTGTTGGAGCCCACG TATGCACTGTGGC-3′-pGL3质粒用HindⅢ和XhoⅠ酶切，T4 DNA连接酶连接，转化Top10感受态细胞，筛选，抽提质粒，酶切和鉴定。

7. 转染与目的基因干扰效率：FuGENE HD转染试剂转染HepG2细胞，加入干扰载体与转染试剂培养，于24、48、72h取细胞，在核酸自动提取仪制备总RNA。以第一链cDNA合成试剂（ReverAidTM）经逆转录合成HIF-1αcDNA。以cDNA为模板，染料法行实时定量PCR，HIF-1α引物为5′-CCACTG CCACCACTGATGAA-3′（nt2254～2273）和5′-TTGGTGAGGCTGTCCGACTT-3′（nt2412～2431），大小178bp。目标片段mRNA以Ratio＝2-ΔΔCt计算（Ct为荧光达到阀值所需的PCR循环数）。3-磷酸甘油醛脱氢酶为内参照（n＝3）。

8. Western blot分析：制作10%分离胶，蛋白40μg，加十二烷基硫酸钠缓冲液，恒定电压80V×35min后100V×60min电泳转膜，封闭。取膜用三乙醇胺缓冲盐水溶液漂洗加鼠抗人HIF-1α（1∶500）4℃过夜，漂洗，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（1∶1000），室温孵育2h，漂洗、DAB显色并摄相。

9 . VEGF、Ang-2定量分析:培养液中VEGF、Ang-2水平以聚合酶联免疫吸附法（ELISA法，试剂购自美国ADL公司)进行定量分析。绘制标准曲线，计算浓度。

10. HIF-1α依赖的报告基因表达分析：以磷酸盐缓冲液洗涤细胞，裂解。酶标板加入荧光素酶检测试剂和裂解产物，测定相对光单位（RLU）；加入终止液，再测定RLU，此为海肾荧光素酶测得的RLU。以海肾荧光素酶为内参照情况下，用萤光素酶测定得到的RLU值除以Renilla荧光素酶测定得到RLU值。

11. 细胞凋亡与细胞周期检测：于转染24h加阿霉素，于48、72h吸取各孔内培养液，洗涤，常规消化。加Annexin V-FLUOS/PI染液，流式细胞仪检测。固定，加PI混合染液，以488nm激发和Macguit软件分析。

12. 统计学方法：所有数据以均数±标准差（x-±s）表示，采用t检验和两因素方差分析及q或q’检验计量资料。用SPSS13.0统计软件包处理、分析数据。以P<0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. miRNA抑制HIF-1α转录：miRNA载体对HepG2细胞HIF-1α mRNA表达的抑制作用见图1。与空白组比，转染24、48、72h后，HepG2细胞HIF-1α mRNA表达（2-ΔΔCt）减少为0.69，0.39和0.13，抑制率为31%、61%和87%，阴性组抑制率分别为9%、7%和17%，经两因素分析，组间差异明显（P＝0.012）。在干扰因素方面：干扰组与空白组差异显著（q’＝9.018，P＝0.003），与阴性对照组间未见明显差异（q’＝7.368，P＝0.061）；在时间因素方面：干扰组与空白组（q’＝3.297，P＝0.000）和阴性对照组间（q’＝1.974，P＝0.000）差异均有统计学意义。

2. miRNA抑制HIF-1α表达：与空白组比较，转染HIF-1α miRNA载体24、48、72h后，HepG2细胞HIF-1α表达明显减少，HIF-1α与β-肌动蛋白灰度扫描比值显示HIF-1α相对表达量分别减少为0.85、0.41和0.35，抑制率分别为15%、59%和65%（P＝0.000）；而阴性组与空白组间差异无统计学意义。经两因素分析，时间因素差异无统计学意义（P＝0.399）；而干扰组与空白组（q’＝6.561，P＝0.000）和阴性对照组间（q’＝6.350，P＝0.000）差异均有统计学意义。

3．HRE-pGL3双荧光素酶报告基因分析：测序证实HIF-1α基因HRE中插入pGL3载体（TCG AGCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTC CTCTTCCCTCCCATGCAA），成功构建了HRE-pGL3报告基因。双荧光素酶报告基因与空白组比较，干扰组24、48、72h HepG2细胞相对光单位分别下降22%、32%和46%。经两因素分析：时间因素方面，组间未见明显差异（P＝0.144）；而干扰组与空白组（q’＝8.696，P＝0.000）和阴性对照组间（q’＝8.953，P＝0.000）差异均有统计学意义（图2）。

4．HIF-1α miRNA对下游基因表达的调控影响：与空白组相比，转染HIF-1α miRNA载体24、48、72h后，培养液VEGF和Ang-2下调水平分别为25%、46%、54%（P值分别为0.004、0.000和0.000）和14%、25%和36%（P值分别为0.015、0.030和0.002）。经两因素分析，无论VEGF或Ang-2组间差异均有统计学意义（P＝0.000）。在干扰因素方面：干扰组与空白组差异有统计学意义（VEGF：q’＝4.341，P＝0.000；Ang-2：q’＝4.429，P＝0.000），与阴性对照组间未见明显差异（VEGF：q’＝11.507，P＝0.000；Ang-2：q’＝4.674，P＝0.000）；在时间因素方面：干扰组与空白组（VEGF：q’＝12.507，P＝0.000；Ang-2：q’＝14.467，P＝0.000）和阴性对照组间（VEGF：q’＝11.141，P＝0.000；Ang-2：q’＝11.226，P＝0.000）差异均有统计学意义。

5． 联合阿霉素促进癌细胞凋亡：转染HIF-1αmiRNA载体48、72h后，HepG2细胞凋亡率均明显增加（P＝0.000），72h组高于48h组；48h联合阿霉素组较单阿霉素组明显增加（q＝22.90，P＝0.000），见表1；72h联合组凋亡率见同样改变（q＝13.74，P＝0.000）。

表1  转染pshHIF-1α48h HepG2细胞凋亡的变化

组别                                  细胞凋亡率（%）    q值             P值

空白组                               3.80±0.12                                 

阴性对照组                       4.84±0.23a               2.10        0.062

干扰组                               15.49±0.99a              23.65          0.000

阿霉素组                           15.91±0.37a              24.50          0.000

阿霉素+干扰组                 27.33±0.94abc           47.40          0.000

  注：a 与空白组比较；b 与干扰组比较，q＝23.75，P＝0.000；c 与单用阿霉素组比较， q＝22.90， P＝0.000

6. 联合阿霉素对细胞生长周期的影响：转染干扰载体48、72h后，HepG2细胞周期时相均发生改变，干扰组G0/G1比率明显高于空白组和阴性组（P＝0.000），S期细胞比率低于空白组和阴性组（P＝0.000）。48h联合阿霉素组较单用阿霉素组G0/G1细胞比率增高（q＝0.097，P＝0.045），S期细胞比率减低（q＝2.240，P＝0.049）；72h联合组较单用阿霉素组G0/G1细胞比率增高（q＝4.503，P＝0.001），S期细胞比率减低（q＝2.480，P＝0.033，表2）。G2/M期细胞比率在各组间差异无统计学意义（P>0.05）。

讨    论

肝细胞恶性转化过程中，肝HIF-1α在转录和蛋白水平上均过表达。在HBV感染相关的HCC癌灶组织中，肿瘤坏死区周围及肿瘤浸润边缘HIF-1α表达增多，癌旁组中靠近肿瘤边缘被压扁的肝组织条索中及中央静脉周围HIF-1α表达明显，以癌周组HIF-1α表达明显强于癌灶组，提示与肝癌发生与发展关系密切[4-5]。肝癌细胞不断增殖导致细胞耗氧量增加，造成组织缺氧微环境。坏死区和浸润边缘HIF-1α表达明显增多，癌基因激活、抑癌基因失活和转录活性增强。癌组织核酸代谢旺盛，多种基因异常表达。肝癌周围组织中总RNA水平明显高于癌灶组，与HIF-1α和HIF-1α mRNA表达规律一致[6]。

肝癌组织中血管丰富，HIF-1α过表达机制，可能与调控癌组织新血管生成参与癌细胞增殖和转移等有关。与新生血管密切相关的重要生长因子是VEGF和Ang-2，它们位于HIF-1α的下游，而Ang-2发挥血管生成作用高度依赖于VEGF的存在[7-8]; 在肝癌形成过程中，两者呈正相关关系，均呈进行性过表达。Ang-2促使毛细血管增大、基底膜重塑、内皮细胞增殖迁移及新生血管出芽，稳定性衰减，增强对血管新生刺激性，加速新生血管形成；反之，Ang-2则诱导内皮细胞凋亡，血管退化；除可刺激血管新生，还可经Tie-2非依赖途径借助整合素介导促进肿瘤转移、侵袭。研究资料证实，干扰HIF-1α后明显下调VEGF和Ang-2表达，显著抑制血管新生，阻断肿瘤进展。下调HIF-1α后，对VEGF抑制强于Ang-2，原因可能在于VEGF可上调Ang-2表达，而在Tie-2存在下Ang-2可在基因及蛋白水平下调VEGF表达。干扰HIF-1α表达后，其下游基因及蛋白表达明显下调，随时间延长干扰效率依次递增，72h达最高, 表现为HRE调控的荧光素酶表达随HIF-1α递减而递减和VEGF、Ang-2表达递减。

手术切除仍是肝癌的首选治疗方法，但肝动脉栓塞或肝动脉化疗栓塞是晚期不可手术肝癌患者的疗法。但因阻断肿瘤血供引起坏死、萎缩，造成缺氧，诱导HIF-1α、VEGF等过表达，导致侧支循环建立，癌细胞逃逸，残余癌细胞迅速增殖，终使治疗失败[9-10]。随干扰HIF-1α时间延长，HepG2细胞凋亡率逐渐增加，且G1期细胞明显增多，S期细胞显著减少，阻断细胞有丝分裂，抑制细胞增殖; 阻断HIF-1α活化，可显著增强化疗敏感性，抑制肿瘤生长。另HIF-1α可上调多重耐药基因mdr1，下调Bax、caspase-3表达，抑制p53活性，参与耐药形成；干扰后可增强化疗药物诱导的凋亡，逆转其化疗耐药。HIF-1α活化干预可在转录和蛋白水平上，明显抑制HIF-1α表达，促进肝癌细胞凋亡; 如miRNA干扰与阿霉素联合, 癌细胞的凋亡率明显高于单纯干预组，表明沉默HIF-1α可显著提高化疗敏感性，沉默HIF-1α可逆转肝动脉栓塞致缺氧引起的HIF-1α、VEGF和增殖核抗原升高, 控制血管新生和癌细胞增殖, 抑制残余癌生长, 加强肝动脉栓塞疗效。且HIF-1α沉默可逆转放化疗耐受，可作为一种辅助策略用于肝癌的治疗。

参  考  文  献

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DOI：10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2011.04.012

基金项目：江苏省自然科学基金（BK2008187）；南通市社会发展项目（S2009027）

作者单位：226001 江苏省南通市，南通大学医学院诊断学教研室（董志珍）；南通大学附属医院临床医学研究中心（姚登福、蔚丹丹、姚宁华、钱雅洁、邱历伟），肿瘤中心（李姗姗），医学检验中心（姚敏）

董志珍 女，51岁，副研究员。

通信作者：姚登福，Email：yaodf@ahnmc.com

(收稿日期：2010-12-17）

（本文编辑：金生)

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