转化生长因子β1及基质金属蛋白酶抑制剂1、2siRNA真核表达载体的构建与鉴定

【摘要】  目的  用RNA干扰技术，分别以转化生长因子（TGF）β1、基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）-1和TIMP-2为靶基因，设计并构建针对TGFβ1、TIMP-1和TIMP-2基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体，并在体外检测其对大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）的TGFβ1、TIMP-1和TIMP-2基因表达的抑制情况。 方法  设计合成TGFβ1、TIMP-1和TIMP-2的siRNA并与含绿色荧光蛋白的pGenesil-1载体连接,构建siRNA真核表达载体，并测序鉴定。体外转染HSC-T6细胞,观察转染效率，并用荧光定量PCR以及Western blot分析对目的基因的抑制效率。组间比较用方差分析, 两两比较用q检验。 结果  成功构建了针对TGFβ1、TIMP-1和TIMP-2基因的siRNA真核表达载体。体外成功转染HSC-T6细胞，转染后的细胞TGFβ1、TIMP-1及TIMP-2 mRNA表达分别下调63.4%±8.0%，64.5%±9.0%，55.0%±17.0%（F值分别为17.55、128.42、210.36，P值均＜0.01），TGFβ1、TIMP-1及TIMP-2蛋白表达分别下降57.8%±3.0%,55.1%±5.0%,49.3%±1.0%（F值分别为130.75、159.09、35.72，P值均＜0.01）。 结论  成功构建了针对TGFβ1、TIMP-1和TIMP-2基因的siRNA真核表达载体；将重组载体成功转染入体外培养的HSC-T6细胞，并显著抑制了目的基因的表达；为进一步研究其在体抑制表达提供了实验工具。

【关键词】  肝硬化； 转化生长因子β； 肝星状细胞

Construction and identification of siRNA eukaryotic expression vectors targeting on TGFβ1, TIMP-1 and TIMP-2 genes in vitro    QIAN Ke-li, XU Ning, LANG Qing, QI Jing-hu, SUN Yin-chun, XIAO Lang, LIU Qi, SHI Xiao-feng. Key Laboratory of Molecular Biology for Infectious Diseases,  Ministry of Education and Department of Infectious Diseases, the Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China

Corresponding  author: SHI Xiao-feng, Email: sxff2003@yahoo.com.cn

Co-corresponding  author: XU Ning, Email: xuning197903@163.com, Department of Intensive Care Unit, the Second Hospital of Yulin, Yulin Shaanxi Province 719000, China

【Abstract】    Objective    To construct the siRNA eukaryotic expression vectors targeting on TGFβ1, TIMP-1 and TIMP-2 and to investigate the inhibitory efficiency of target genes expression on rat hepatic stellate cell in vitro. Methods    The siRNA cDNA sequences of TGFβ1, TIMP-1 and TIMP-2 were designed, synthesized and inserted into plasmid pGenesil-1 respectively to generate eukaryotic expression plasmids. The plasmids were transfected into HSC T6 cells in vitro and the inhibitory efficiency of target genes expression was observed with real-time PCR and Western blot. Results    The eukaryotic expression vectors were constructed successfully. The expressions of TGFβ1 mRNA, TIMP-1 mRNA and TIMP-2mRNA in siRNA-transfected groups were decreased by 63.4%±8.0%, 64.5%±9.0% and 55.0%±17.0% respectively and the expressions of TGFβ1 protein, TIMP-1 protein and TIMP-2 protein were decreased by 57.8%±3.0%, 55.1%±5.0%, 49.3%±1.0% respectively as compared to the control groups. Conclusions    The siRNA eukaryotic expression vectors constructed targeting on TGFβ1, TIMP-1 and TIMP-2 could reduce the expressions of target genes and they might be able to used for the exploration of new anti-fibrosis drugs genetically.

【Key words】     Liver cirrhosis;    Transforming growth factor beta;    Hepatic stellate  cells

基质金属蛋白酶（MMPs）是一类可以降解细胞外基质（ECM）的蛋白水解酶，它的活性与其活性蛋白的量及基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）的浓度密切相关[1-2]。TIMPs在肝纤维化的病理生理学过程中有着重要的作用[3]。TIMPs及MMPs的调节主要与肝星状细胞（HSC）相关[4]。当肝脏损伤时，HSC在转化生长因子（TGF）β1等细胞因子的作用下被激活，使TIMP-1、TIMP-2的表达上调，抑制MMPs的活性使得ECM不能被MMPs及时降解造成堆积，导致肝纤维化甚至肝硬化的发生[5]。

本研究以TGFβ1、TIMP-1和TIMP-2为靶点, 体外构建小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）真核表达载体, 并体外转染肝星状细胞株（HSC-T6细胞）, 研究通过干扰TGFβ1的表达来降低ECM的合成；干扰TIMP-1及TIMP-2的表达来促进ECM的降解，从生成与降解两方面探讨RNAi技术在抗肝纤维化方面的作用。

材料与方法

1. 实验材料：大鼠HSC-T6细胞株购自中国科学院肿瘤细胞库；大肠杆菌JM109及其载体pGenesil-1由本实验室保存；限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ、PstⅠ和T4 DNA连接酶及DNA凝胶回收试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；小量质粒提取试剂盒购自美国Omega公司；siRNA转染试剂Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；新生小牛血清购自美国HyClone公司；总RNA抽提试剂盒购自北京百泰克公司；TGFβ1、TIMP-1、TIMP-2及3-磷酸甘油醛脱氢酶引物由大连宝生物公司合成；RT-PCR试剂盒及荧光定量PCR试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；大鼠TGFβ1多克隆抗体、小鼠β-肌动蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记抗小鼠免疫球蛋白G及抗兔免疫球蛋白G均购自武汉博士德公司；大鼠TIMP-1、TIMP-2单克隆抗体均购自英国Abcam公司。

2. TGFβ1、TIMP-1和TIMP-2 siRNA表达载体的构建：根据基因库中大鼠TGFβ1、TIMP-1和TIMP-2基因的序列（录入号分别为NM_021578、 NM_021989、AY_550026）及siRNA设计原则，各自选取2个靶点作为不同的干扰区域（TGFβ1 siRNA1：811～831nt；TGFβ1 siRNA2：1001～1021nt；TIMP-1 siRNA1：297～317nt；TIMP-1 siRNA2：434～454nt；TIMP-2 siRNA1：478～498nt；TIMP-2 siRNA2：551～571nt）。每条寡核苷酸长度均为69nt，包括两端用于形成酶切位点的序列、21nt的编码区序列、用于形成茎环的9nt序列、反向互补序列保护碱基、作为终止信号的6个胸腺嘧啶核苷。同时分别针对TGFβ1、TIMP-1和TIMP-2设计非特异性靶序列作为阴性对照，并将设计序列进行BLAST比较避免与其他基因同源。以上设计好的寡核苷酸由大连宝生物工程有限公司合成。将合成好序列与载体pGenesil-1连接。重组载体分别命名为：Psi-TGFβ1-1、Psi-TGFβ1-2、Psi-TIMP1-1、Psi-TIMP1-2、Psi-TIMP2-1、Psi-TIMP2-2，3个阴性对照载体分别命名为Psi-TGFβ1-HK、Psi-TIMP1-HK和Psi-TIMP2-HK。

3. 重组载体酶切、测序鉴定：重组载体分别转化感受态大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆。培养后小量提取试剂盒提取重组载体，将9个重组质粒各自分别用SalⅠ和PstⅠ单酶切，并用10g/L琼脂糖凝胶电泳。经SalⅠ酶切后，预期片段大小约400bp。酶切鉴定正确的克隆送大连宝生物工程有限公司进行测序进一步确认。

4. 实验分组：按不同处理批次和处理因素将HSC-T6细胞分为正常HSC-T6细胞A组、Psi-TGFβ1-1组、Psi-TGFβ1-2组、Psi-TGFβ1-HK组、正常HSC-T6细胞B组、Psi-TIMP1-1组、Psi-TIMP1-2组、Psi-TIMP1-HK组、正常HSC-T6细胞C组、Psi-TIMP2-1组、Psi-TIMP2-2组、Psi-TIMP2-HK组。

5. 重组载体转染HSC-T6细胞：HSC-T6细胞用含10%新生小牛血清的DMEM培养基（每1000ml含葡萄糖4.500g、谷氨酰胺0.584g、丙酮酸钠0.110g、碳酸氢钠3.700g，pH7.2～7.4），37℃、5% CO2培养箱培养，细胞贴壁85%～90%时，用胰酶消化。将对数生长期的HSC-T6消化，稀释成1×105个/ml，接种于6孔培养板，待细胞铺满80%左右时转染。首先用无血清无青霉素、链霉素DMEM培养基洗涤2遍。取重组质粒4μg,加无血清无青霉素、链霉素DMEM培养基250μl；脂质体10μl, 加无血清无青霉素、链霉素DMEM培养基250μl。静置5min，将二者轻轻混匀，室温孵育20min，加入6孔板中常规培养，4～6h换生长培养基。分别于24h和48h在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，细胞质内带有绿色荧光的细胞即为转染成功的细胞。

6.荧光定量PCR检测HSC-T6细胞TGFβ1、TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表达：收集各组siRNA处理的HSC-T6细胞，用RNA抽提试剂盒提取总RNA，紫外分光光度计测量RNA浓度及吸光度值。按逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒说明书取1μg总RNA逆转录合成cDNA。然后按照荧光定量PCR试剂盒说明书以Sybr Green作为荧光标记物, 在ABI PRISM 7300荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。PCR引物如下：TGFβ1正义链5′-TGCGCCTGCAGAGATTCAAG-3′，反义链5′-AGGTAACGCCAGGAATTGTTGCTA-3′；TIMP-1正义链5′-ACAGGTTTCCGGTTCGCCTAC-3′，反义链5′-CTGCAGGCAGTGATGTGCAA-3′；TIMP-2正义链5′-GACACGCTTAGCATCACCCA GA-3′，反义链5′-CTGTGACCCAGTCCATCCA GAG-3′；3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）正义链5′-TGATTCTACCCACGGCAAGTT-3′，反义链5′-TGATGGGTTTCCCATTGATGA-3′。用两步法PCR扩增标准程序，反应条件如下：95℃ 10s；95℃ 5s，60℃ 31s，40个循环。并增加溶解曲线步骤：95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。用2-ΔΔCt（Ct值为荧光达到循环阀值所需的PCR次数）法来计算相对mRNA的含量，ΔCt＝Ct（目的基因）-Ct（管家基因GAPDH），ΔΔCt＝ΔCt（实验组）-ΔCt（正常组），2-ΔΔCt表示转染后mRNA的含量较转染前的倍数，2-ΔΔCt≤0.5定义为显著下调，目的基因抑制率为（1-2-ΔΔCt）×100%[6]。

7. Western blot检测HSC-T6细胞TGFβ1、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表达：收集各组siRNA处理的HSC-T6细胞，用百泰克细胞裂解液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度。蛋白变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳，然后湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%牛血清白蛋白封闭，分别用特异性第一抗体及相对应的第二抗体孵育。化学发光法分别检测聚偏二氟乙烯膜上TGFβ1、TIMP-1、TIMP-2及β-肌动蛋白的表达量。然后用Bandscan5.0测定条带的吸光度值。用特异性基因吸光度值/管家基因（β-肌动蛋白）吸光度值进行相对定量。

8. 统计学方法：所有资料用SPSS13.0统计分析软件进行处理, 所得到的数据以均数±标准差（x-±s）表示, 组间差异用方差分析, 两两比较用q检验进行处理, P<0.05为差异有统计学意义。

结     果

1. 重组载体的酶切和测序鉴定：重组载体经SalⅠ酶切后均可得到400bp片段，而不能被限制性内切酶PstⅠ切断（图1），初步提示重组载体构建成功。将酶切鉴定正确的重组表达载体扩增，提取质粒送TaKaRa公司测序确认。测序结果与目的序列相同，已将目的片段定向克隆至载体上。

2. 体外转染：可以见到各转染组均有大量带荧光的细胞，重组质粒转染成功,见图2。

3. TGFβ1、TIMP-1和TIMP-2 mRNA表达的影响：Psi-TGFβ1-1组、Psi-TGFβ1-2组较正常HSC-T6细胞A组TGFβ1基因的表达下调63.4%±8.0%，Psi-TGFβ1-1组的下调较Psi-TGFβ1-2组明显，最高达到68.8%（F＝17.55，P＜0.01）；而Psi-TGFβ1-HK组TGFβ1基因表达与正常HSC-T6细胞A组差异无统计学意义。Psi-TIMP1-1组，Psi-TIMP1-2组较正常HSC-T6细胞B组TIMP-1基因的表达下调64.5%±9.0%，Psi-TIMP1-1组的下调较Psi-TIMP1-2组明显，最高达到72.5%（F＝128.42，P＜0.01）；而Psi-TIMP1-HK组TIMP-1基因表达与正常HSC-T6细胞组差异无统计学意义。Psi-TIMP2-1组，Psi-TIMP2-2组较正常HSC-T6细胞C组TIMP-2基因表达下调55.0%±17.0%，Psi-TIMP2-2组的下调较Psi-TIMP2-1组明显，最高达到67.5%（F＝210.36，P＜0.01）；而Psi-TIMP2-HK组TIMP-2基因表达与正常HSC-T6细胞组差异无统计学意义，见表1。

4. TGFβ1、TIMP-1和TIMP-2蛋白的表达：Psi-TGFβ1-1组TGFβ1相对表达量为0.31±0.03，Psi-TGFβ1-2组细胞TGFβ1相对表达量为0.39±0.02，平均较正常HSC-T6细胞A组TGFβ1相对表达量（0.83±0.01）下降了57.8%±3.0%（F＝130.75，P＜0.05），正常HSC-T6细胞组及Psi-TGFβ1-HK组的TGFβ1表达差异无统计学意义（q＝0.05，P＞0.05）（图3A）。Psi-TIMP1-1组TIMP-1相对表达量为0.30±0.03，Psi-TIMP1-2组细胞TIMP-1相对表达量为0.38±0.02，平均较正常HSC-T6细胞B组相对表达量（0.76±0.02）下降了55.1%±5.0%（Ｆ＝159.09，P＜0.05），正常HSC-T6细胞组及Psi-TIMP1-HK组的TIMP-1表达差异无统计学意义（q＝0.25，P＞0.05）（图3B）。Psi-TIMP2-1组TIMP-2相对表达量为0.40±0.02，Psi-TIMP2-2组细胞TIMP-2相对表达量为0.36±0.01，平均较正常HSC-T6细胞C组表达量（0.75±0.02）下降了49.3%±1.0%（Ｆ＝35.72，P＜0.05），正常HSC-T6细胞组及Psi-TIMP2-HK组的TIMP-2表达差异无统计学意义（q＝2.45，P＞0.05）（图3C）。

讨    论

肝纤维化是各种病因引起的慢性肝病共有的病理学改变，其本质是ECM的合成增多，而降解相对减少而导致其在肝内过量沉积所致[7]。对肝纤维化的细胞及分子机制研究表明，多种细胞及细胞因子参与了肝纤维化形成的病理生理过程。其中HSC活化为成纤维细胞是生成ECM的关键步骤[8]。其中TGFβ1被认为是HSC活化的最关键的细胞因子[9]。 在正常情况下它与其他细胞因子一起处于一种网络平衡状态，共同维持肝脏内环境的稳定。病理状态下，TGFβ1可促进HSC活化，使ECM产生，减少其降解；并且也合成、分泌TGFβ1。HSC在大量旁分泌与自分泌的TGFβ1作用下被进一步活化，从而使ECM在肝脏大量沉积导致纤维化[10-12]。在ECM的降解过程中起主要作用的是MMPs，而其活性可被其特异性抑制剂TIMPs所抑制[13]。在肝内，主要的TIMPs为TIMP-1及TIMP-2[14]。MMPs和TIMPs在正常状态下处于动态平衡，调节肝内ECM的生成与降解。在病理状态下，MMPs/TIMPs的失衡会引起ECM质和量的变化。在肝脏致病因素作用下，MMPs活性降低，阻止ECM降解，导致ECM正常转换发生障碍；另一方面，活化的HSC使TIMPs表达增强，对MMPs的抑制进一步增加，使ECM降解减少，沉积增加[1]。因此，肝纤维化的防治包括两个方面：一方面是抑制ECM的合成；另一方面是加速ECM的降解。即从ECM的合成与降解两方面入手，分别抑制TGFβ1及TIMP-1、TIMP-2，使ECM的生成减少，MMPs的活性增高而降解ECM增多，使肝纤维化减轻。

RNA干扰是指通过与目的基因同源的双链siRNA介导特异性降解靶RNA，导致转录后水平的基因沉默的现象, 它通过21～23nt的dsRNA或短发夹RNA与特异性mRNA结合导致靶基因的降解，进而导致目的产物表达下调[15]。它作为一种生物维持基因组完整性、保护基因组免受外来核酸入侵的手段，广泛存在于真菌、植物、线虫等中。在这些生物中，RNA干扰是稳定、持久的，并且可以遗传给后代。由于哺乳动物细胞缺乏可以扩增siRNA的RNA依赖的RNA聚合酶，siRNA转染哺乳动物细胞引起的基因沉默作用十分短暂。为解决这个问题，研究出了以载体为基础的方法，使得siRNA可以在细胞中稳定表达[16]。这些载体含有RNA聚合酶Ⅲ启动子，可以转录表达短发夹RNA，进一步由Dicer酶切割生成siRNA。因此，载体表达的RNAi较反义寡核苷酸等其他基因沉默技术更适宜于试验研究[17]。因此，我们用载体表达siRNA技术，选用含有RNA聚合酶Ⅲ的U6启动子连接目的基因短发夹RNA。这种载体表达的siRNA不仅在细胞内可以有效稳定表达，并且可以降低免疫反应以及毒性反应。

根据以上思路，我们用siRNA技术，成功构建了以TGFβ1、TIMP-1和TIMP-2为靶点的siRNA真核表达载体，并将其体外转染HSC-T6细胞，荧光定量PCR及Western blot检测结果显示其转染的HSC-T6细胞的目的基因mRNA及蛋白表达均低于对照组的表达，证明了我们合成的siRNA真核表达载体对目的基因表达有较强的特异性抑制效果。其中psi-TGFβ1-1、psi-TIMP1-1、psi-TIMP2-2抑制率较高，而psi-TGFβ1-2、psi-TIMP1-2、psi-TIMP2-1抑制效果差，可能与选择干扰的靶基因位点有关。

参  考  文  献

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DOI：10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2011.04.014

基金项目：国家自然科学基金（30671867）

作者单位：400010 重庆医科大学附属第二医院感染科重庆医科大学病毒性肝炎研究所 教育部感染性疾病分子生物学重点实验室（钱克莉、郎清、戚敬虎、孙银春、肖朗、刘杞、石小枫）；陕西省榆林市第二医院重症医学科（徐宁）

钱克莉 女，24岁，硕士研究生。

通信作者：石小枫，Email：sxff2003@yahoo.com.cn；徐宁，719000，Email：xuning197903@163.com

(收稿日期：2010-12-05)

（本文编辑:孙宇航）

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