【关键词】 肝炎，乙型，慢性； 树突状细胞； 胸腺肽α1 In vitro effect of thymosin alpha 1 on the function of dendritic cells derived from chronic hepatitis B patients LU Gao-feng, TANG Fu-ai, ZHENG Peng-yuan. 【Key words】Hepatitis B, chronic ; Dendritic cell; Thymosin alpha 1 【First author’s address】Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450014, China Corresponding author: TANG Fu-ai, Email: tangfuai@ 126.com 树突状细胞（DC）是人体内抗原提呈能力最强的抗原提呈细胞（APC），在抗病毒的细胞免疫中起重要作用[1]。慢性乙型肝炎（CHB）形成的重要原因之一是患者DC功能低下[2]；胸腺肽α1是一种由28个氨基酸构成的胸腺多肽，被广泛用于调节机体免疫，促进T淋巴细胞功能可能是其重要机制之一。作为临床上治疗CHB的重要辅助用药，我们对胸腺肽α1调节CHB患者DC功能进行了研究。 一、资料与方法 1. 临床资料与实验材料：按慢性乙型肝炎防治指南[3]标准，选择郑州大学第二附属医院CHB患者25例，年龄18～42岁，中位数29岁，男性18例，女性7例；HBV标志物HBsAg、HBeAg、抗-HBc阳性，HBV DNA>1×108拷贝/L（PCR），ALT为85～420U/L。实验抽血前3个月内未接受抗病毒或免疫调节药物治疗，排除合并HCV、HDV、HIV等病毒感染和其他自身免疫相关疾病。10名健康志愿者为郑州大学硕士研究生，男性8例，女性2例，年龄中位数26岁，均排除肝炎及其他免疫性疾病，作为健康对照。 RPMI 1640培养基购自美国Gibco BRL公司；淋巴细胞分离液购自津脉基因测绘技术有限公司；重组人白细胞介素4(rhIL-4)、重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、荧光标记鼠抗人HLA-DR-FITC，CD80-PE，CD83-PE，CDla-PE单克隆抗体，对照抗体IgG-FITC，IgG-PE购自美国R&D公司；胸腺肽α1购自成都地奥制药集团有限公司，完全培养基成分：含10% FBS的RPMI 1640培养基， 加入细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4，终浓度均为10ng/ml。 2. 方法：（1）标本采集与DC培养：分别采集CHB患者和健康志愿者抗凝外周静脉血25ml，淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，等渗盐水洗涤2次后以无血清RPMI 1640培养基悬浮沉淀细胞，调整细胞浓度至(1～2)×109个/L；按每孔1ml加入24孔细胞培养板中，37℃，5% CO2培养箱中温育3h后，洗去悬浮细胞，所得贴壁细胞为单核细胞。每孔加入2ml完全培养基，37℃，5% CO2恒温培养箱中培养，隔天半量换液，第4天，按以下分组：①健康人对照；②CHB阴性对照；③CHB患者DC＋胸腺肽α1（0.1μg/ml）。（2）DC形态观察及表型检测：通过倒置显微镜进行细胞形态学观察；第8天收集细胞（简称DC8）。用流式细胞仪进行细胞表型分析。（3）同种异体混合淋巴细胞反应：取健康人外周血，如前法获得单个核细胞后置入24孔细胞培养板，37℃培养2h，取非贴壁细胞即为淋巴细胞作为反应细胞；上述收获的部分DC8用丝裂霉素C（50mg/L）孵育30min后，分别以1×104个/孔加入96孔平底培养板，每组各3个复孔，每组再加入同种T淋巴细胞2×105个，终体积为200μl，培养72h，于培养结束前4h每孔加入四甲基偶氮唑盐20μl，离心弃去培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，振荡10min，使结晶物充分溶解。自动酶联检测仪检测570nm波长的吸光度（A）值，结果用3孔均值表示。设单独DC，T淋巴细胞和培养基空白对照孔。并计算刺激指数（SI）表示增殖情况。SI＝实验组A值/（反应细胞对照组A值＋刺激细胞对照组A值）。（4）DC培养上清液中白细胞介素（IL-6）和IL-12浓度测定：按照酶联免疫吸附试剂盒步骤分别检测每组DC培养上清液中IL-6和IL-12浓度。 3. 统计学方法：数据采用均数±标准差（x-±s）表示，用SPSS10.0统计软件包进行方差检验，组间两两比较采用LSD-t检验。以α＝0.05为检验水准。 二、结果 1．DC形态观察：培养24h后可见细胞呈集落生长，8d时健康对照组可见培养液中漂浮着颜色较深、云雾状的细胞团；胸腺肽α1处理组细胞向多方向突起，呈不规则状；CHB阴性对照组变形细胞较少（图1）。 2．DC表型检测：DC表型分子CD1a，CD83，CD80和HLA-DR的表达水平，健康对照组最高，CHB阴性对照组最低，三组间差异具有统计学意义（P<0.05），见表1。 3．淋巴细胞增殖能力测定：健康对照组DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力最强（SI＝1.78±0.09），胸腺肽α1组其次（SI＝1.69±0.10），CHB对照组最弱（SI＝1.42±0.08），3组间差异有统计学意义（P<0.01），两两比较，组间差异也具有统计学意义（P<0.05）。 4．DC培养上清液中IL-6和IL-12浓度测定：健康对照组、CHB对照组和胸腺肽α1组DC培养上清液测定IL-6浓度分别为（48.53±11.20）pg/ml、（96.86±16.35）pg/ml和（72.48±14.16）pg/ml（P<0.05）；IL-12浓度分别为（302.55±52.02）pg/ml、（131.26±26.33）pg/ml和（228.68±46.5）pg/ml（P<0.05）。 三、讨 论 慢性肝炎患者体内DC抗原提呈功能缺陷，不能把病毒抗原的信号传递给机体的免疫系统，诱导机体内HBV抗原特异性的CD8+ T细胞大幅度下降，导致机体内抗原特异性T淋巴细胞免疫耐受，造成CHB的发生[4]。因此，如果能增强APC的功能，则可能有助于CHB的治疗。我们应用DC免疫治疗CHB已取得初步成效[5]。 机体内的APC，尤其是DC是特异性免疫应答的关键细胞，启动和介导特异性T淋巴细胞免疫应答。DC是机体内最重要的、功能最强的APC，能诱导免疫应答的产生，同时在诱导免疫耐受和参与免疫应答的调节中也起着重要作用[6]。外周血来源的DC主要分为未成熟DC和成熟DC，后者加工、处理抗原能力弱，提呈抗原能力强。DC摄取抗原并将其处理成具有免疫原性的多肽，通过交叉提呈，与主要组织相容性复合物（MHC）Ⅰ类分子结合后，以MHC-抗原肽复合物的形式表达于细胞膜表面，其膜表面的协同刺激分子与T细胞表面相应配体结合，激活CD8+ T淋巴细胞，进而激活细胞毒性T淋巴细胞，产生免疫应答[7]。若DC膜表面协同刺激分子表达缺陷，则影响其与T淋巴细胞表面相应配体结合，从而影响机体产生正常免疫应答；本研究结果表明，CHB患者DC表面低表达CD80、CD83和人类白细胞抗原-DR等共刺激分子，从免疫应答方面阐明了HBV感染慢性化的部分机制。 胸腺肽α1对免疫调节的机制尚未阐明。我们通过研究CHB患者的外周血DC发现胸腺肽α1与DC共孵育后提高了DC表面CD1a、CD80、CD83、HLA-DR的表达，DC表型分子表达上调可能与T淋巴细胞形成共刺激通路而传递抗原信息，继而激活体内HBV特异性免疫反应有关；此外，可能还有以下机制：（1）活化p38-丝裂原活化蛋白激酶和核因子-κB信号传导途径，促进DC分化成熟[8]；（2）诱导前列腺素生成，且和人干扰素α具有结构同源性，而前列腺素和干扰素α均可促进DC成熟[9]；（3）通过MyD88依赖途径促进DC分泌Th1型细胞因子IL-12等[10]；（4）诱导DC内吲哚胺2，3-双加氧酶活性，从而影响对自身抗原和细菌非自身抗原的耐受[11]。 参 考 文 献 [1]Akbar SM, Inaba K, Onji M. 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