PERKeIF2α通路在酒精性肝损伤大鼠肝细胞凋亡中的作用

【摘要】  目的  探讨内质网类似激酶（PERK）/真核生物翻译起始因子（eIF）2α信号通路在酒精性肝损伤大鼠肝细胞凋亡中的作用。 方法  建立大鼠酒精性肝损伤模型。设4、6、10周和12周4个时间点，动态观察肝组织病理变化；流式细胞术检测肝细胞凋亡率；酶联免疫吸附法检测血清同型半胱氨酸（tHCY）水平；实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot检测肝组织PERK/eIF2α通路信号分子mRNA和蛋白的表达水平。多组样本均数的两两比较采用One-Way ANOVA分析。 结果  4周时造模大鼠发生急性肝损伤改变，12周时则出现慢性肝损伤改变；6周时造模大鼠肝细胞凋亡率较正常组显著增加（P<0.05），随着造模时间的延长，肝细胞凋亡程度逐渐加剧，12周时早期和总凋亡率分别达到26%和29%；自6周起，造模大鼠血清tHCY水平明显高于正常大鼠（P<0.01）；自4周起，造模大鼠肝组织eIF-2α蛋白发生明显磷酸化，12周时peIF-2α蛋白表达量上升了2.81倍（P<0.01），葡萄糖调节蛋白（GRP）78/Bip、GRP94、caspase-12和caspase-3则表现为过度活化，12周时基因和蛋白表达量分别为正常大鼠的4.70、12.95、3.83、4.05倍和3.93、6.93、9.88、3.31倍（P<0.01）。 结论  PERK/eIF2α通路的活化与酒精性肝损伤大鼠肝细胞凋亡的发生和持续发展密切相关。

【关键词】  肝疾病，酒精性； 应激，内质网； 细胞凋亡； eIF-2α； 信号通路

Role of PERK/eIF2α signaling pathway in hepatocyte apoptosis of alcoholic liver injury rats   HAN Xiang-hui*, WANG Jian-yi, WANG Lei, ZHENG Pei-yong, JI Guang.*Institute of Gastroenterology, Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China

Corresponding author: JI Guang, Email: jiliver@vip.sina.com

【Abstract】    Objective    To investigate the role of PERK/eIF2α signaling pathway in hepatocyte apoptosis of alcoholic liver injury rats. Methods    Rat models with ethanol-induced liver injury were successfully developed by gastric gavage with ethanol-corn oil mixtures for 12 weeks. At different time points (4, 6, 10, 12 week), liver pathology was dynamically observed. The hepatocyte apoptosis was quantitatively analyzed by AnnexinV-FITC/PI double-labeled flow cytometry, the serum total homocysteine (tHCY) level was detected by ELISA and the expressions of eIF2α, p-eIF2α, GRP78/Bip, GRP94, caspase-3 and caspase-12 in liver were examined using Real-time PCR and Western blot. Results    Typical acute liver injury and chronic liver injury were observed at week 4 and week 12 respectively. The hepatocyte apoptosis rates in 6-week model rats significantly increased compared with normal rats (P < 0.05), and the degree of hepatocyte apoptosis continued to increase with the modeling time,  and the percentages of early and total apoptosis reached 26% and 29% at week12. From week 6 to week 12, the serum tHCY levels in model rats were obviously higher than in normal rats (P < 0.01). Since week 4, eIF2α protein phosphorylation in model rat livers remarkly elevated compared with that in normal rat livers (P < 0.01), and at week 12 the peIF2α protein expression in model rat livers increased by 2.81-fold. Since week 4 the expressions of GRP78/Bip, GRP94, caspase-12 and caspase-3 mRNA and protein in model rat livers showed a significant increase as compared to normal rat livers, and at week 12, these gene and protein levels increased 4.70, 12.95, 3.83, 4.05 fold and 3.93, 6.93, 9.88, 3.31 fold, respectively (P < 0.01). Conclusion    Activation of PERK/eIF2α signaling pathway contributes to the occurrence and development of hepatocyte apoptosis in alcoholic liver injury rats and it might be as a potential target for therapeutic applications in alcoholic liver diseases.

【Key words】     Liver diseases, alcoholic;    Stress, endoplasmic reticulum;    Apoptosis;    eIF-2α; Signaling pathway

内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）介导的肝细胞凋亡与酒精性肝病（ALD）的发病密切相关。RNA依赖蛋白激酶内质网类似激酶（PKR-1ike ER kinase，PERK）/真核生物翻译起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2 alpha, eIF2α）信号通路是ERS反应性凋亡通路之一，它参与了肝细胞凋亡的激活过程，显著增加肝脏和脂肪组织中JNK、葡萄糖调节蛋白（GRP）94、GRP78/Bip等ERS标志物的表达水平[1]。目前，有关PERK/eIF2α信号通路的关键分子在酒精性肝损伤发生和发展过程中的变化规律尚缺乏深入研究，本研究旨在探讨PERK/eIF2α通路在慢性酒精性肝损伤中的作用，从而寻求ALD预防和治疗的新途径及有效靶点。

材料与方法

1. 材料：膜黏连蛋白（annexin）Ｖ-异硫氰酸荧光素（FITC）细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；Trizol购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自美国MBI公司；GRP78/Bip、GRP94、caspase-12、caspase-3和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物由上海英骏生物工程公司合成；兔抗大鼠eIF2α、p-eIF2α、GRP78/Bip、GRP94和caspase-12多克隆抗体购自英国Abcam公司；其余试剂均为分析纯品。

2. 动物造模与分组：雄性SD大鼠60只［无特定病原级，合格证号为SCXK（沪）2003-0003号］，购自上海斯莱克实验动物有限公司，分层随机分为4、6、10、12周模型组及正常对照组。大鼠慢性酒精性肝损伤模型参照课题组原有造模方法并加以改进[2]。每日上午以乙醇混合液［56%（v/v）白酒-玉米油-吡唑］15ml/kg灌胃1次，每周按0.3ml/kg剂量腹腔注射CCl4橄榄油溶液1次，连续12周，正常对照组给予等量的生理盐水。分别于造模后4、6、10、12周各选择10只动物，戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血, 处死, 分离肝脏。其中部分新鲜肝组织立即进行细胞凋亡检测，其余肝组织-70℃冻存，或10%甲醛固定后、石蜡包埋、切片, 行常规HE染色。

3. 膜黏连蛋白V/碘化丙啶（annexin V/PI）双标记法检测肝细胞凋亡：新鲜肝组织剪碎至1mm3大小，置于100目铜网上轻搓, 边搓边以等渗盐水冲洗，2500r/min（r＝6.4cm）离心5min，弃去上清液及细胞碎片，收集细胞悬液；冷磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤2遍，用结合缓冲液调整细胞浓度至1×106个/ml；加入annexin V-FITC和PI各5μl；旋涡混匀，避光室温孵育15min后立即用流式细胞仪检测，Cell Quest软件分析数据。

4. 酶联免疫吸附法检测血清总同型半胱氨酸水平：各组动物血清按照大鼠同型半胱氨酸（tHCY）酶联免疫吸附法检测试剂盒操作程序进行， 450nm波长下酶标仪测定各孔吸光度（A）值。以标准品不同稀释浓度为横坐标，A值为纵坐标作标准曲线图，根据样品A值查出相应tHCY含量。

5. 实时荧光定量聚合酶链反应检测肝组织GRP78/Bip、GRP94、caspase-3和caspase-12 mRNA的表达：取100mg组织放入研钵中加液氮粉碎， Trizol法提取总mRNA，分光光度计测定RNA浓度，-80℃冻存。应用逆转录试剂盒对总mRNA进行逆转录，合成cDNA；反应条件为：30℃ 10min，42℃ 60min，99℃ 5min，5℃ 5min。取0.5μl cDNA于25μl反应体系进行聚合酶链反应扩增。内参照选用GAPDH，所用引物序列根据GenBank公布的相关数据设计，各引物序列见表1。扩增条件为95℃ 30s，62℃ 45s，72℃ 45s，40个循环。数据采用ABI Prism 7300 SDS Software分析，2-ΔΔCt法对各组样本目的基因Ct值（荧光达到阈值时所需要的循环次数）进行相对定量计算。以GAPDH为内参照基因，4周模型组为校正样本，其2-ΔΔCt＝1。ΔCt＝Ct（目的基因）－Ct（内参基因），ΔΔCt＝ΔCt（目的基因）－ΔCt（校正样本基因）。

6. Western blot检测肝组织eIF2α、p-eIF2α、GRP78/Bip、GRP94、caspase-3和caspase-12蛋白的表达：100mg肝组织放入研钵中加液氮粉碎，先加入RIPA缓冲液0.3ml，4℃匀浆（15000r/min, r＝6.4cm, 1min）；然后加入PMSF储存液3μl，冰浴30min，离心（15000r/min, r＝6.4cm, 15min）；分离上清液，Lowery比色法测定蛋白含量。每个样品上样50μg，经十二烷基硫化钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，转膜、封闭，封闭后分别加入eIF2α、p-eIF2α、GRP78/Bip、GRP94、caspase-3和caspase-12和β-肌动蛋白的多克隆抗体，4℃过夜；洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体，4℃反应1h。化学发光法试剂作用后，X线胶片曝光，经显影、定影处理后观察结果。凝胶成像及分析系统扫描图像，进行灰度分析，以目的条带/β-肌动蛋白条带灰度比值表示各样本表达强度。

7. 统计学方法：数据以均数±标准差（x-±s)表示，SPSS18.0软件进行数据处理，多组样本均数的两两比较采用One-Way ANOVA分析（方差齐，LSD法；方差不齐，Games-Howell法），检验水准α＝0.05，P<0.05表示差异有统计学意义。

结    果

1. 肝组织的病理变化：大体观察，正常大鼠肝脏被膜光滑，呈红褐色，质地柔软。随着造模时间的延长，造模大鼠肝脏病变程度逐渐加重，12周时表现为肝脏表面粗糙，有白色脂肪斑点，体积增大，呈土黄色，质地较脆。镜下观察，正常大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列，肝窦正常；4周模型组大鼠肝索排列界限较清晰，但出现大泡性脂肪滴，部分细胞溶解、坏死；6周模型组大鼠肝索界限较清晰，但肝细胞出现脂肪变性、部分细胞坏死；10周模型组大鼠肝索界限不清晰，脂肪变性和炎性浸润明显，细胞膜溶解坏死；12周模型组大鼠肝索界限不清，肝细胞质出现不同程度的空泡变性，脂肪变性明显，内含大小不等的脂滴，肝小叶可见不同程度的点状或灶状坏死，坏死区及肝窦内可见大量炎症细胞浸润，个别坏死区可见纤维细胞增生（图略）。

2. 肝细胞凋亡的动态变化：流式细胞散点图中(图略)，左下象限表示正常活细胞；右下象限表示早期凋亡细胞；左上象限（UL）表示死亡细胞；右上象限（UR）表示晚期凋亡细胞。结果显示，正常大鼠肝细胞早期凋亡率和总凋亡率分别为4.97%和5.62%。6周造模大鼠肝细胞总凋亡率明显高于正常大鼠（P<0.05）。之后随着造模时间的延长，大鼠肝细胞凋亡程度逐渐加重，12周时早期凋亡率和总凋亡率分别达到26%和29%，与正常及4周模型组比较，差异具有统计学意义（F值分别为13.248、10.349，P<0.05，表略）。

3. 大鼠血清tHCY水平的变化：造模4周时，大鼠血清tHCY水平与正常对照组比较没有明显变化；而自第6周起，大鼠血清tHCY水平明显升高，并一直保持到第12周，各时间点造模大鼠与正常和造模4周大鼠比较，差异均有统计学意义（F＝9.963，P<0.01，表略）。

4. 大鼠肝组织GRP78/Bip、GRP94、caspase-3和caspase-12 mRNA表达的动态变化：正常对照组大鼠肝组织caspase-12、caspase-3、GRP94和GRP78/Bip mRNA相对表达量（即2-ΔΔCt值）分别为0.420 (0.211～0.839)，0.440 (0.266～0.728)，0.144 (0.059～0.347)，0.475 (0.281～0.809)。随着造模时间的延长，各凋亡基因的表达水平呈逐步上升趋势。其中4周模型组caspase-12、caspase-3、GRP94和GRP78/Bip mRNA的相对表达量分别是正常对照组的2.38、2.27、6.94和2.10倍；6周模型组各基因的表达量分别是正常对照组的2.86、3.10、7.89和3.08倍；10周模型组各基因的表达量分别是正常对照组的3.61、3.69、9.68和3.80倍；12周模型组各基因的表达量分别是正常对照组的3.83、4.05、12.95和4.70倍（图略）。

5. 大鼠肝组织eIF2α、p-eIF2α、GRP78/Bip、GRP94、caspase-3和caspase-12蛋白表达的动态变化：在正常大鼠肝组织中，eIF2α蛋白有较高表达，当给予乙醇复合试剂后，其表达量随着造模时间的延长逐渐降低，12周时仅为正常大鼠的53.89%，与eIF2α蛋白相反，其磷酸化产物p-eIF2α蛋白表达量则以正常大鼠肝组织中最低，随着造模时间的延长逐渐升高，12周时已达到正常大鼠的3.81倍。各组间差异均具有统计学意义（P<0.01）。自4周或6周起, 造模大鼠肝组织GRP78/Bip、GRP94、caspase-3和caspase-12蛋白表达量明显高于正常大鼠 (P<0.05或P<0.01)，随着造模时间的延长，这些凋亡蛋白的活化呈现逐渐升高的趋势，12周时分别达到了正常大鼠的3.93、6.93、9.88、3.31倍 (表略，图略)。

讨    论

国外研究结果证实，酗酒者常表现为高半胱氨酸血症，乙醇通过减弱蛋氨酸合成酶活性造成机体同型半胱氨酸代谢紊乱，后者能够引发过度ERS，导致肝细胞凋亡[3]。在乙醇饲养的动物模型中，乙醇通过高半胱氨酸介导ERS反应来影响肝细胞凋亡相关因子的表达，如GRP78、GRP94、CHOP等ERS应答基因表达增加及CRADD、caspase-l2、caspase-7等凋亡因子的上调[4-5]。

ERS介导细胞凋亡包括两种机制，非折叠蛋白反应和钙离子起始信号[6]。正常情况下内质网膜上的转录因子PERK以无活性的状态与内质网分子伴侣GPR78结合，ERS发生时，大量未折叠蛋白或错误折叠蛋白质发生堆积（即非折叠蛋白反应），GRP78则从PERK上解离而改为与非折叠蛋白结合，引起PERK反向自身磷酸化。磷酸化的PERK催化底物eIF-2α发生磷酸化，磷酸化eIF-2α（peIF-2α）能激活一种转录因子，诱导GRP78、GRP94等内质网分子伴侣蛋白表达增加及caspase-12的活化，启动细胞凋亡程序[7-9]。在LPS诱导的肝硬化大鼠模型及体外诱导肝细胞ERS的研究中发现，PERK/eIF2α通路参与了肝细胞凋亡的激活过程，肝脏和脂肪组织中ERS标志物如peIF2α、JNK、GRP94及GRP78水平均显著增加，并表现出强烈的非折叠蛋白反应[1,3]。

本研究结果表明，在酒精性肝损伤形成和发展进程中发生的肝细胞凋亡与同型半胱氨酸代谢紊乱引起的过度ERS有关。对PERK/eIF2α通路中关键信号分子的研究结果显示，相对于正常大鼠，慢性酒精肝损伤模型大鼠4周时eIF-2α蛋白发生明显磷酸化，同时PERK/eIF2α通路的下游信号分子GRP78/Bip、GRP94、caspase-12和caspase-3发生过度活化，并随着肝细胞凋亡程度的加重，这些基因和蛋白的表达呈递增趋势，表明PERK/eIF2α通路在酒精性肝损伤发生和发展中具有重要作用，它不仅参与了乙醇诱导的ERS肝细胞凋亡的启动，而且其活化程度与酒精性肝损伤大鼠肝细胞凋亡的持续发展和加剧密切相关。这些结果提示我们，靶向性阻断PERK/eIF2α信号通路将可能为酒精性肝病提供新的治疗途径。

参  考  文  献

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（收稿日期：2010-04-13）

（本文编辑：金生）

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