p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂减少大鼠肝脏炎症细胞因子的表达

【摘要】目的  观察p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂SB203580阻断p36 MAPK信号通路，减少脑死亡大鼠肝脏促炎细胞因子表达的作用。 方法  雄性Wistar大鼠30只，体质量180～200g，随机分3组，每组10只。脑死亡组：诱导大鼠脑死亡；脑死亡+SB203580组：大鼠脑死亡诱导成功后，经阴茎背静脉注射SB203580（10mg/kg）；两组大鼠脑死亡诱导成功，行人工呼吸6h后，若平均动脉压大于80mmHg（1mmHg＝0.133kPa），则为脑死亡供体，获取肝脏待检。对照组：正常大鼠麻醉后取肝脏待检。逆转录-聚合酶链反应检测肝脏肿瘤坏死因子（TNF）α和白细胞介素（IL）-1β的mRNA表达，Western blot检测肝脏TNFα和IL-1β的蛋白质表达以及磷酸化p38 MAPK的表达。多个样本间比较行One-Way ANOVA分析，SNK法行两两样本间比较。 结果  脑死亡组大鼠肝脏出现p38 MAPK磷酸化，磷酸化p38 MAPK的相对表达量比对照组明显增加（0.190±0.004比0.001±0.002），差异有统计学意义（q＝172.53，P<0.01）；肝脏TNFα的mRNA和蛋白质表达量分别为0.670±0.012和0.240±0.003，较对照组（分别为0.130±0.013和0.001±0.002）明显增加（q值分别为123.99和243.09，P值均<0.01）；肝脏IL-1β的mRNA和蛋白质表达量分别为0.560±0.009和0.190±0.003，较对照组（分别为0.160±0.010和0.001±0.002）明显增加（q值分别为135.35和192.23，P值均<0.01）。脑死亡-SB203580组大鼠肝脏p38 MAPK磷酸化下降，磷酸化p38 MAPK的表达量（0.120±0.004）比脑死亡组明显下降（q＝63.90，P<0.05），但仍明显高于对照组（q＝108.63，P<0.01）；肝脏TNFα的mRNA和蛋白质表达量分别为0.430±0.016和0.180±0.004，较脑死亡组明显下降（q值分别为55.11和61.03，P值均<0.01），但仍高于对照组（q值分别为68.89和182.60，P值均<0.01）；肝脏IL-1β的mRNA和蛋白质表达量分别为0.270±0.009和0.140±0.004，较脑死亡组明显下降（q值分别为98.13和50.85，P值均<0.01），但仍高于对照组（q值分别为37.22和1041.38，P值均<0.01）。 结论  SB203580能抑制p38 MAPK的磷酸化，阻断p38 MAPK信号通路，减少脑死亡大鼠肝脏促炎细胞因子表达，降低肝脏免疫原性。

【关键词】脑死亡； 肝脏； 肿瘤坏死因子； 白细胞介素1； p38丝裂原活化蛋白激酶

p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor suppresses the expression of pro-inflammatory cytokines in liver from brain dead rats   CHEN Jie, LIU Jia-wen, ZENG Hui-lan, ZENG Yao-ying, SU Ze-xuan. Department of Organ Transplantation, the First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510630, China

Email: jkcharite@ yahoo.com.cn

【Abstract】 Objective    To observe the suppressive effect on the expression of pro-inflammatory cytokines in liver from brain dead (BD) rats through inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway by SB203580. Methods    A total of 30 male Wistar rats weighing from 180 to 200 g were randomly divided into 3 experimental groups: (1) BD group (n = 10): brain death was induced in rats; (2) BD+SB203580 group (n = 10): brain death was successfully induced and SB203580 (10 mg/kg) was given through dorsal vein of penis. After brain death artificial ventilation was maintained for 6 hours and only those with mean arterial blood pressure more than 80 mm Hg (1 mm Hg = 0.133 kPa) were accepted as BD donors. (3) Control group (n = 10): living healthy rats. The expressions of TNFα and IL-1β mRNA in liver tissues were analyzed by RT-PCR and the protein expressions of TNFα, IL-1β and phosphorylated p38MAPK were detected by Western blot. Results    The phosphorylated p38MAPK detected in the liver in BD group was significantly increased compared with the control group (q = 172.53, P < 0.01), and the expressions of TNFα and IL-1β mRNA and proteins in liver were also significantly increased in BD group compared with the control group (q = 123.99, 135.35, 243.09 and 192.23, respectively, P < 0.01). The phosphorylated p38MAPK was decreased in BD+SB203580 group and significantly decreased compared with the BD group (q = 63.90, P < 0.05), but higher than that in control group (q = 108.63, P <0.01). The expressions of TNFα and IL-1β mRNA and proteins in liver were significantly decreased in BD+SB203580 group compared with the BD group (q = 55.11, 98.13, 61.03 and 50.85, respectively, P < 0.01), but higher than that in control group (q = 68.89, 37.22, 182.06 and 141.38, respectively, P < 0.01). Conclusion    SB203580 can suppress the expression of pro-inflammatory cytokines in the liver of brain dead rats through the inhibition of p38MAPK signaling pathway which may reduce the immunogenicity of donor livers.

【Key words】Brain death; Liver; Tumor necrosis factor; Interleukin-1; p38 mitogen-activated protein kinase

供体脑死亡后外周器官促炎细胞因子、黏附分子和趋化因子等表达增多，加快移植后急、慢性排斥反应的发生[1]。移植前干预脑死亡供体，降低供体器官炎症状态，是国内外学者关注的焦点[2]。本研究旨在观察SB203580阻断p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路对脑死亡大鼠肝脏促炎细胞因子表达的抑制，及降低肝脏免疫原性的作用。

材料与方法

1. 实验动物：雄性无特定病原体级Wistar大鼠30只，体质量180～200g，购自南方医科大学实验动物中心。

2．实验试剂：M-MLV购自美国Promega公司，核糖核酸酶抑制剂、脱氧核糖核酸酶Ⅰ（无核糖核酸酶）、Realtime PCR Master Mix购自日本TaKaRa公司；Western blot及IP细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物公司，PVDF膜购自美国Bio-Rad公司，羊抗白细胞介素（IL）-1β多克隆抗体、兔抗肿瘤坏死因子（TNF）α多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，鼠抗β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体购自美国Protein Tech Group公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（H+L）、HRP标记的兔抗羊IgG（H+L）、HRP标记的羊抗小鼠IgM购自北京博奥森生物技术公司，增强型HRP-二氨基联苯胺（DAB）底物显色试剂盒购自北京天根公司；蛋白质及核酸相对分子质量标准购自加拿大Fermentas公司，150bp DNA标记购自日本TaKaRa公司；RNA抽提试剂 TrizoL购自美国Invitrogen公司，焦碳酸二乙酯（DEPC）购自美国Sigma-Aldrich公司。p38 MAPK阻滞剂SB203580 购自美国Beyotime公司。

3．实验仪器设备：WILD M690显微镜购自德国Leica公司，ALC-V8A动物呼吸机购自上海奥尔科特生物科技公司，BL-420E+生物机能实验系统购自成都泰盟科技公司。T1热循环PCR仪购自德国Biometra公司，凝胶扫描分析系统购自英国Syngene公司，DU-640型蛋白/核酸分析仪购自美国Beckman公司，6131型蛋白检测仪和5804R型高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，SD半干转印仪购自美国Bio-Rad公司，水平、垂直电泳系统购自英国Amersham PHarmacia公司。

4．动物分组及处理：大鼠随机分3组，每组10只。脑死亡组：诱导大鼠脑死亡。脑死亡+SB203580组：大鼠脑死亡诱导成功时，经阴茎背静脉注射SB203580（10mg/kg）。脑死亡组及脑死亡+ SB203580组大鼠脑死亡诱导成功，行人工呼吸6h后，若平均动脉压＞80mmHg（1mmHg＝0.133kPa），则成为脑死亡供体，取其肝脏待检。对照组：正常大鼠麻醉后获取肝脏待检。

5．诱导大鼠脑死亡：参考文献[3]。10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔内麻醉，左侧股动脉置管，持续监测血压。气管插管，连接ALC-V8A动物呼吸机，呼吸频率105次/min，潮气量3.0ml。大鼠俯卧位，剪去头部组织至骨膜，在大鼠矢状线中点右侧0.2～0.5cm处钻一直径1mm的孔，将3F Fogarty动脉取栓管（购自加拿大Baxter Healthcare公司）垂直插入颅内，缓慢注入等渗盐水，逐渐扩大导管气囊，增加颅内压致脑干疝和脑死亡形成。脑死亡诊断标准：自主呼吸停止，无条件反射，瞳孔放大固定。

6．逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）检测肝脏TNFα和IL-1β mRNA表达：用Primer5.0设计引物，上海生工生物公司合成。TNFα上、下游引物序列分别为5′-CAGACCCTCACACTCAG ATCATC-3′和3′-GTCGGCTAAACGGTAAAGT AT-5′，产物长269bp。IL-1β上、下游引物序列分别为5′-GAAATAGCAGCTTTCGACAGTGAG-3′和3′-CCTGGGTTCGTGGAAGAAAAG-5’，产物长254bp。内参照3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）上、下游引物序列分别为5′-TGTTCCTACCCC CAATGTGTC-3′和3′-CGCTGAAGTTGTCGT TGAGGG-5′，产物长170bp。RNA提取试剂盒提取总RNA。按RT-PCR试剂盒说明操作，扩增条件：94℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 1min，共30个循环；72℃延伸4 min。取5μl扩增产物，20g/L琼脂糖凝胶电泳。用Alpha EaseFC软件分析相对表达量。

7．Western blot检测大鼠肝脏TNFα、IL-1β蛋白和磷酸化p38 MAPK的表达：配细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。各样本提取等量总蛋白。经100℃ 5min变性后，进行十二烷基磺酸钠-聚丙聚烯胺凝胶电泳。电泳后将凝胶上的蛋白条带电转移至PVDF膜。第一抗体（1∶200）4℃孵育过夜，第二抗体（1∶2000）室温孵育1h。增强型HRP-DAB底物显色，显色完毕后拍照并用Alpha EaseFC软件分析TNFα、IL-1β蛋白和磷酸化p38 MAPK的表达量，均以β-actin为内参照。

8．统计学方法：数据以均数±标准差（x-±s）表示，应用SPSS13.0统计软件进行分析，多个样本间比较行One-Way ANOVA分析，SNK法行两两样本间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

结    果

1．肝脏TNFα和IL-1β mRNA表达：脑死亡组大鼠肝脏TNFα和IL-1β mRNA表达比对照组明显增加，差异有统计学意义（q值分别为123.99和135.35，P值均<0.01）。脑死亡+SB203580组大鼠肝脏TNFα和IL-1β的mRNA表达比脑死亡组明显降低（q值分别为55.11和98.13，P值均<0.05），但仍高于对照组（q值分别为68.89和37.22，P值均<0.01）。见图1和表1。

表1  大鼠肝脏肿瘤坏死因子α和白细胞介素-1β的mRNA表达（相对表达量，x-±s）

组别       动物数（只）       肿瘤坏死因子α    白细胞介素-1β

对照组    10    0.130±0.013        0.160±0.010

脑死亡组       10    0.670±0.012        0.560±0.009

脑死亡+SB203580组    10    0.430±0.016        0.270±0.009

2．Western blot检测肝脏TNFα和IL-1β蛋白及磷酸化p38 MAPK表达：脑死亡组大鼠肝脏TNFα和IL-1β蛋白及磷酸化p38 MAPK表达明显高于对照组，差异有统计学意义（q值分别为243.09、192.23和172.53，P值均<0.01）。脑死亡+ SB203580组大鼠肝脏TNFα和IL-1β蛋白及磷酸化p38 MAPK表达较脑死亡组明显下降（q值分别为61.03、50.85和63.90，P值均<0.05），但仍明显高于对照组（q值分别为182.06、141.38和108.63，P值均<0.01）。见图2和表2。

表2  大鼠肝脏肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的

蛋白质和磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶的

表达（相对表达量，x-±s）

组别       动物数    肿瘤坏死       白细胞介素    磷酸化p38丝裂原

       （只）    因子α    1β  活化蛋白激酶

对照组    10    0.001±0.002  0.001±0.002        0.001±0.002

脑死亡组       10    0.240±0.003  0.190±0.003        0.190±0.004

  脑死亡+

SB203580组  10    0.180±0.004        0.140±0.004        0.120±0.004

讨    论

供体严重缺乏使许多终末期肾病患者在等待肾移植的过程中死亡。脑死亡供体越来越多地成为国外和许多地区临床器官移植主要供体来源之一。供体脑死亡导致血管强烈收缩、阻力增加，外周器官血流灌注减少，造成组织缺血、缺氧；同时，释放的大量促炎细胞因子（包括TNFα、IL-1β、IL-6等）、趋化因子、黏附分子使外周器官免疫原性增加，移植后加速急、慢性排斥反应的发生，严重影响移植物的长期存活和功能[4-9]。

p38 MAPK信号传导通路对非特异性炎症反应中的炎症介质生成有重要的调控作用[10-11]。多个缺血再灌注损伤的动物实验结果表明，肾脏、肝脏和心脏出现p38 MAPK磷酸化，上调炎症因子转录和表达，诱发局部炎症反应，造成组织损伤[12-13]。供体脑死亡后，外周器官大量促炎细胞因子释放，激活了p38 MAPK通路，促进基因转录，生成更多炎症介质，这可能是脑死亡后外周器官损害的一个重要机制。

SB203580是p38 MAPK特异性抑制剂，抑制p38 MAPK磷酸化，减轻炎症反应。本研究结果显示，供体脑死亡后，肝脏TNFα和IL-1β的mRNA和蛋白质表达与正常大鼠相比均明显升高，而且肝脏p38 MAPK磷酸化也明显增加，提示供体脑死亡时p38 MAPK信号通路被激活，p38 MAPK参与调节炎症介质的生成[14]。供体脑死亡诱导成功时静脉注射SB203580，可抑制肝脏p38 MAPK磷酸化，阻断p38 MAPK信号通路，显著减少下游促炎细胞因子TNFα和IL-1β的转录和释放，证实p38 MAPK信号通路与脑死亡引起的炎症反应关系密切，与我们的前期实验结果相似[15]。

总之，SB203580能特异性地抑制p38 MAPK磷酸化，阻断p38 MAPK信号通路，减少脑死亡大鼠肝脏炎症细胞因子表达，降低肝脏免疫原性。

参  考  文  献

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陈洁,曾耀英,曾慧兰,等.阻断p38MAPK信号通路降低脑死亡大鼠肾脏免疫原性.中华实验外科杂志,2009,26:1509-1511.

（收稿日期：2010-03-16）

（本文编辑：黄晨）

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