Wntβ连环素信号通路对肝细胞癌信号分子的调节作用及其意义

【摘要】目的  研究肝细胞癌中Wnt/β-连环素信号传导通路与糖原合成激酶（GSK）-3β、STAT3、Smad3和人端粒酶逆转录酶（TERT）的关系及其意义。 方法  用RNAi技术将针对β-连环素的siRNA转染入肝癌细胞系HepG2细胞中沉默β-连环素基因，于72h和96h提取蛋白质，用Western blot法检测β-连环素、GSK-3β、p-GSK-3β、STAT3、Smad3和TERT蛋白质的表达。用Student’s t检验及方差分析进行统计学分析。 结果  针对β-连环素的siRNA转染HepG2细胞72h和96h均可抑制β-连环素蛋白质的表达，且96h比72h的表达略有增加（t ＝4.43, P<0.05），而GSK-3β及p-GSK-3β的蛋白质表达于转染后72h和96h依次增加（tGSK-3β＝4.98，tp-GSK-3β＝29.83, P值均<0.05）；STAT3的蛋白质表达于转染前后一致，差异无统计学意义（F＝0.49，P>0.05）；smad3的蛋白质表达于转染后72h增加（t＝10.67, P<0.05），96h减少至原有水平（与转染前比较，t＝0.90, P＞0.05）；TERT的蛋白质表达于转染后72h减少（t＝4.18, P<0.05），96h增加至原有水平（t＝1.26, P＞0.05）。 结论  肝细胞癌中Wnt/β-连环素信号通路可能通过调节GSK-3β、p-GSK-3β、Smad3、TERT蛋白质的表达来参与肝癌的发生和发展过程；而与STAT3蛋白质的表达无关。

【关键词】癌,肝细胞； RNA干扰； β-连环素； 信号传导通路； 端粒酶

The role and significance of  Wnt/β-catenin signaling pathway regulating the signaling molecules in  hepatocellular carcinoma   WANG Xin-hong, SUN Xun, MENG Xiang-wei, L Zhi-wu, LIU Ming-na, PEI Feng-hua. Department of Gastroenterology, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130012, China

Corresponding author: MENG Xiang-wei, Email: xiangweimeng2003@ yahoo.com.cn

【Abstract】 Objective    To investigate the role and significance of Wnt/β-catenin signaling pathway regulating GSK-3β, STAT3, Smad3 and TERT in hepatocellular carcinoma (HCC). Methods    The HCC cell line HepG2 was transfected with small interfering RNA (siRNA) directed against β-catenin. Proteins were extracted and the expressions of β-catenin, GSK-3β, p-GSK-3β, STAT3, Smad3 and TERT were detected by Western blot at 72 h and 96 h respectively after transfection. Results    β-catenin expression was inhibited at both time points and the expression at 96 h was higher than that at 72 h (t = 4.43, P < 0.05). Interestingly, GSK-3β and p-GSK-3β expressions increased gradually at 72 and 96 h (tGSK-3β= 4.98, tp-GSK-3β= 29.83, P < 0.05) respectively, and STAT3 expression showed no alteration after transfection (F = 0.49, P > 0.05). Smad3 expression was increased at 72 h (t = 10.67, P < 0.05) and decreased to normal at 96 h (t = 1.26, P < 0.05), while TERT expression decreased at 72 h (t = 4.18, P < 0.05) and increased to normal at 96 h (t = 1.26, P > 0.05).  Conclusions    Wnt/β-catenin signaling pathway is related to the expressions of GSK-3β, Smad3 and TERT, but perhaps not related to STAT3 protein expression in HCC. It suggested that Wnt/β-catenin signaling pathway might participate in HCC genesis and development through regulating the above three factors.

【Key words】Carcinoma, hepatocellular; RNA interference; β-catenin; Signaling pathway;   Telomerase

目前，已知与肝癌发生和发展有密切关系的主要细胞信号传导通路有Wnt/β-连环素（β-catenin）、Ras/MAPK、PI3K/Akt、JNK/STAT、核因子（NF）-κB、转化生长因子（TGF）β/Smad、Hh通路等。其中，Wnt/β-连环素、JNK/STAT和TGFβ/Smad信号传导通路是最为重要的一部分，它们的关系也为世人瞩目。β-连环素是细胞质中的一种多功能蛋白[1]，处于Wnt信号传导通路的中心，其异常可导致细胞发生癌变。STAT3被认为是一种癌基因，在多发性骨髓瘤、淋巴瘤、乳腺癌等和源于肿瘤的细胞株中都有其异常表达。Smad 蛋白家族在细胞增殖分化、胚胎发生、血管形成和肿瘤发生中起着重要作用,是迄今已被证明的TGFβ受体作用的底物，Smad3是调控TGFβ抑制作用的关键因子[2]。糖原合成激酶（glycogen synthase kinase，GSK）-3β是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞的生长、发育，肿瘤发生等过程中发挥着重要的作用,其异常表达可见于结肠癌、克隆病、黑色素瘤等疾病中。GSK-3β参与PI3K/Akt[3]、Ras/MAPK[3]和Wnt/β-catenin信号途径的调控。端粒酶是众所周知的肿瘤标志物之一, 90%以上的肿瘤可表达端粒酶活性，其激活与肿瘤细胞增殖和永生化密切相关。

考虑以上情况，我们应用RNAi技术沉默β-连环素基因的表达，来研究肝细胞癌中Wnt/β-连环素信号传导通路与JNK/STAT、TGF-β/Smad信号通路及人端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）和GSK-3β的关系，以进一步揭示Wnt/β-连环素信号传导通路在肝癌发生和发展中的作用以及信号传导通路之间的关系。

材料与方法

一、实验材料

肝癌细胞株HepG2细胞购自中国生命科学院细胞库，转染试剂lipofectamineTM2000购自美国Invitrogen生物公司，siRNA由上海吉玛生物公司设计并合成，含高糖DMEM培养基购自浙江Hecoly生物公司，新鲜胎牛血清购自天津TBD生物公司，鼠抗β-连环素、兔抗GSK-3β、兔抗p-GSK-3β、兔抗STAT3、兔抗Smad3和兔抗TERT抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠和羊抗兔的第二抗体均购自美国Santa生物公司。针对β-连环素的siRNA序列正义链为5′-GGGUUCAGAUGAUAUAAAU TT-3′，反义链为5′-AUUUAUAUCAUCUGAAC CCAG-3′。

二、实验方法

1. 细胞培养：HepG2细胞用含高糖及10%新鲜胎牛血清的DMEM培养基置于5% CO2培养箱中37℃培养，待细胞长满后，用0.25%的胰蛋白酶消化1min左右，将贴壁细胞吹打下来分至新培养瓶中，置于细胞培养箱中继续培养。

2. 转染：取3×105个状态良好的HepG2细胞接种入六孔细胞培养板中，使其在24h内达到30%～50%融合，将500μl的siRNA/lipofectamineTM 2000复合物加入到含细胞及无血清含高糖DMEM培养基的培养板中，来回轻柔摇晃细胞培养板。细胞在CO2培养箱中37℃孵育6h后，更换为含血清及高糖的DMEM培养基，继续孵育直至提取蛋白质。对照组则不加转染试剂。每组设3个复孔，重复3次实验。

3. 蛋白质的提取及含量测定：分别于转染后72h及96h将细胞裂解液加入培养板中提取蛋白质。用BCA法检测蛋白质的含量，即取20μl待测样本加入96孔板中，再加入200μl BCA混合试剂，放入37℃温箱孵育30min后，取出放至室温，用酶标仪检测吸光度，对照标准曲线计算待测样本的蛋白质含量。

4. Western blot法检测蛋白质的表达：每例标本取总蛋白60μg，加热变性后，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用半干式电转印仪将蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上，转膜90min，将膜取出放入50g/L的脱脂奶粉溶液中，37℃摇床上封闭1h。再将膜放入相应第一抗体中4℃孵育过夜，第一抗体工作浓度为1∶200。洗膜后放入辣根过氧化物酶标记的相应第二抗体中37℃孵育1h，第二抗体工作浓度为1∶5000。洗膜后DAB 显色，待出现明显条带时，用蒸馏水终止反应。

三、统计学方法

用Student’s t检验及方差分析的方法进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. siRNA转染肝癌HepG2细胞后β-连环素的表达：针对β-连环素的siRNA转染肝癌HepG2细胞后，分别于72h和96h提取蛋白质进行Western blot检测，可见β-连环素蛋白质的表达于72h和96h均被抑制，而96h比72h时的表达略有增加（t＝4.43, P<0.05），见图略。

2. siRNA转染肝癌HepG2细胞前后GSK-3β、STAT3、Smad3和TERT蛋白表达比较：GSK-3β及p-GSK-3β的蛋白质表达于转染后72h和96h依次增加（tGSK-3β=4.98, P<0.05；tp-GSK-3β=29.83, P<0.05）。STAT3的蛋白质表达于转染前后一致，差异无统计学意义（F＝0.49，P>0.05）。Smad3的蛋白质表达于转染后72h增加（t＝10.67，P<0.05），96h减少至原有水平（t＝0.90, P＞0.05）。TERT的蛋白质表达于转染后72h减少（t＝4.18, P<0.05），96h增加至原有水平（t＝1.26, P＞0.05），见图略。

讨    论

RNAi技术已成功用于基因功能和信号传导系统上下游分子相互关系的研究，为肿瘤的治疗提供了新的方法及思路。本研究结果显示，针对β-连环素的siRNA转染HepG2细胞后，72h和96h均可抑制β-连环素蛋白质的表达， 这正是RNAi技术在实际应用中的结果。

在我们的实验中，抑制β-连环素的蛋白质表达72h和96h后，GSK-3β及p-GSK-3β的蛋白质表达依次增加，这与我们其他实验研究的p-p44/42的表达类似。而且现有研究结果表明，GSK-3β的磷酸化可由丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）途径调控[4]。故出现这样结果的原因可能是β-连环素的蛋白质表达被抑制后，MAPK家族代偿了它的变化，从而直接或间接引起了GSK-3β的变化。现有研究结果显示，GSK-3β是Wnt信号通路的重要组成部分，与肿瘤抑制蛋白APC、axin组成复合物磷酸化β-连环素，导致β-连环素广泛降解[5]，即GSK-3β是β-连环素的上游调节因子，可以调节其表达[6-7]。β-连环素被抑制后，GSK-3β可能因为剩余而增多。GSK-3β可通过多条信号通路参与肿瘤的发生及发展。

在我们的实验中，抑制β-连环素的蛋白质表达72h和96h后，STAT3的蛋白质表达未见改变，说明β-连环素信号通路可能不能调节STAT3的表达，这与一些研究结果不同。如：在结肠癌中STAT3 的活性与β-连环素的聚集有关[8]；在食管癌中转染β-连环素可增强STAT3 的mRNA和蛋白质水平[9]；在鼠的胚胎干细胞中Wnt/β-连环素通路可以上调STAT3 的mRNA和蛋白质水平[10]。其原因可能是不同的肿瘤细胞中信号通路略有差别所致，故β-连环素对JNK/STAT信号通路是否有影响还需要进一步研究。

在我们的实验中，抑制β-连环素的蛋白质表达72h和96h后，Smad3的蛋白质表达于转染后72h增加，96h减少至原有水平；而TERT的蛋白质表达于转染后72h减少，96h增加至原有水平，说明β-连环素信号通路可直接或间接影响二者的表达，并且二者还受其他多种因素的影响。这与近来的一些研究结果类似，如在管状上皮细胞中，抑制β-连环素表达可以增强Smad3的表达[11]；TGF-β及 mitogen-activated protein kinase kinase-1 (MEK1)是Smad3的重要调节因子之一[12]，这些因素可能代偿了β-连环素的作用，所以96h时Smad3表达又减少至原有水平。还有研究结果显示，Smad3能成功阻断癌细胞增殖所必须的物质端粒酶[13-15]。所以TERT出现了和Smad3相反的变化。

总之，Wnt/β-连环素信号通路可能通过调节GSK-3β、p-GSK-3β、Smad3、TERT蛋白质的表达来参与肝癌的发生、发展过程；而与STAT3蛋白质的表达无关。这些信号传递途径之间可交叉激活，构成一个错综复杂的网络。细胞依靠各种信号传递途径中的信号分子的活化来完成其增殖、分化、发挥功能和凋亡的生命过程，只有彻底弄清信号传递过程和相互关系，才能了解肿瘤的发生、发展、转归，并采取合适的预防措施，而且有望通过干扰细胞内的信号传导，特异地控制细胞生长、分化和凋亡来达到在分子水平治疗肿瘤的目的。

参  考  文  献

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（收稿日期：2009-12-23）

（本文编辑：金生）

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