乙型肝炎病毒基因分型的标签序列研究

【摘要】  目的  快速、准确地鉴定HBV基因型，寻找基因型间特异性的序列标签。 方法  通过生物信息学手段，比对分析美国国立生物技术信息中心数据库中930条各型HBV基因组序列的大S区域，选择型间具有高度特异性的序列片段作为分型标签序列，以此设计引物，通过PCR实验对重庆地区的80例临床HBV阳性血清样本进行分型观察。 结果  HBV基因组大S区的149～169nt和461～483nt两段区域含有多个保守的型间差异位点；在8种基因型标签对构成的28种型组合中，27种组合的碱基总差异数均≥6；PCR实验和电泳结果证实，来自该两区段的序列标签引物能够获得特异性的产物，有效鉴定出HBV基因型。 结论  HBV基因大S区的149～169nt和461～483nt两段序列可作为HBV基因型分型标签序列，用作引物探针设计或测序标签。

【关键词】  肝炎病毒，乙型； 基因型； 标签序列

Identification of HBV genotype-specific tag sequences     CAI Ying, LI Xue-cheng, WU Xiao-mei, WANG Ning, CAO Hong-wei, WEI Guo, ZHAO Ke-cen, ZHENG Kai, ZHENG Jiang, LI Yan. Department of Infectious Diseases, No.324 Hospital of PLA, Chongqing 400020, China

Corresponding author: LI Yan, Email: liyan.com@gmail.com. Medical Research Center, Southwest Hospital, Third Medical University. Chongqing 400038, China

【Abstract】    Objective    To indentify the HBV genotype-specific tag sequence. Methods    The large S region sequences from 930 HBV genomes were aligned to identify the genotype-specific tag sequences. PCR was used to check the genotyping effect of these tags. Results    Two tag sequences, sequence between 149-169 and sequence between 461-483, were identified in the large S region. Using primers specific to these tag sequences, the genotype of HBV can be specifically identified. Conclusion    These tag sequences can be used for HBV genotyping.

【Key words】     Hepatitis B virus;    Genotype;     Sequence tag

对HBV进行基因分型不仅有助于流行病学调查及对病毒进化与变异的研究，也对未来制定新的治疗方案、评估疗效和分析转归具有实用价值[1-2]。目前的实验室分型方法有很多种，如聚合酶链反应（PCR）微板核酸杂交-酶联免疫吸附（ELISA）技术及Microarray芯片技术等[3]。无论分型方法如何，特异性的型间标记是准确分型的关键[4]。本研究通过生物信息学手段，对来自美国国立生物技术信息中心公布的930条各型序列的大S区域进行比对分析，明确了HBV具有高度特异性的基因型标签序列，并对重庆地区的80例临床HBV阳性血清样本进行分型观察。

材料与方法

1．材料：数据来自GenBank中的913条HBV全基因组序列，其中A型131例，B型249例，C型308例，D型93例，E型66例，F型43例，G型13例，H型8例。标本为随机收集的第三军医大学西南医院中心实验室经荧光定量PCR检测报告为HBV阳性的血清标本（HBV DNA>105拷贝/ml），共80例。

2．主要试剂及仪器：Taq PCR masterMix及50bp DNA梯度标准购自北京天根公司，HBV DNA提取液购自深圳匹基公司。Icycler PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

3．引物合成：引物由上海生工生物工程公司合成，各引物序列见表1。

4．标本DNA提取方法：采用匹基公司的沉淀裂解法，取100μl血清，加入100μl“DNA提取液Ⅰ”震荡混匀，13000r/min离心10min，吸弃上清液，再加入25μl“DNA提取液Ⅱ液”，煮沸10min，13000r/min离心10min，取5μl上清液作为PCR模板。

5．PCR检测：采用25μl反应体系，取PCR管加入2×Taq Master Mix 12μl，上、下游引物各1μl，模板2μl，用双蒸水补足体系总量。同时设定不加模板的阴性对照。PCR扩增条件：95℃ 5min；94℃ 30s，51℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min。

6．电泳：称取2.5g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入100 ml 0.5×Tris-硼酸（TBE）稀释缓冲液，放入微波炉加热至全部熔化，取出摇匀。冷至60℃时加入5μl（浓度为10mg/ml）溴化乙锭摇匀后制胶板。上样时，取1μl 6×Loading缓冲液+5μl PCR产物；标记为6μl 50bp DNA梯度标准。电泳：160V，≥40mA，45min。  

7．生物信息学分析方法：采用Lasergene的单核苷酸多态性（single nucleotide polymophism，SNP）分析程序显露型间差异位点，通过Haploview单倍型分析软件观察这些位点的相关度。采用ClustalX获取基因型内的一致性序列[5]。通过Mega 4.0 软件比对获得特异性的差异位点[6]。

结    果

1．HBV B、C基因型间特异性位点及其分布：首先对HBV B、C基因型大S区域序列进行SNP位点分析，发现高替换率（＞30%）的SNP位点有80个，其型内保守度＞94.96%，同时，Haploview结果显示，D’＝0.96±0.05，LOD＝52.71±11.17，r2＝0.833±0.139，二者均提示这些位点为型间特异性位点。在序列上的分布来看，半数特异性位点集中于前半部分序列，即1～500bp长度范围内（以B、C型基因组序列的S基因起始作为第1位点），其中149～169nt和461～483nt区域最为密集，前者含有7个特异位点，后者含有6个特异位点。

2．HBV基因型间特异性标签序列的筛选：根据上述结果，对其他各基因型进行分析。采用HBV各基因型一致性序列，分别对大S区域的149～169nt和461～483nt区域的2段20多个碱基进行型间两两比对，观察各基因型之间的相互差异位点。结果显示8种基因型之间总共具有28种组合，除基因型F与H之间差异极小外，其他27种型间序列比较，双片段总差异数均＞6，总差异度为23.3%±6.5%（表2），提示二者联合可反映HBV基因型，可用作HBV基因型的特征标签。

3. PCR实验鉴定标签序列的特异性：在上述两区段的特异性标签序列位置，取各基因型（A～H）的一致序列，分别设计一对引物，对临床HBV阳性样本（HBV DNA >105拷贝/ml）进行PCR扩增，并通过电泳观察目的片段，评估检出效果。每个样本分3组进行检测比较：（1）使用一对非特异性引物覆盖各型样本，扩增产物作为阳性标准量对照；（2）采用标签序列中A～H型特异性引物分别扩增产物，与标准量对比；（3）采用传统分型引物扩增作为分型参考比较。

核酸电泳图谱显示：（1）无论对于基因B型还是C型，非特异性引物均能获得清晰的目的带（393bp）；（2）目标基因型产物电泳条带也十分清晰（334bp），且与非特异性产物的量比约为1∶1，同时，与该样本基因型无关的其他各型特异性引物无目的条带出现，由此证实了该标签序列的分型引物能够特异性地区分基因B、C型，而且不与其他型发生彼此交叉；（3）针对同一样本，传统B、C型引物扩增产物在相应目标位置（156bp）同时出现了较淡的条带，与非特异性产物比较，其量比只有约0.25∶1.00，由此提示上述传统方法难以区分B、C型（图1，2）。在80例样本中，利用该标签序列引物更能有效鉴别B、C基因型，检测出B基因型43例，C基因型31例，分型检出率达92.5%；对其中20例抽样调查，发现上述传统分型方法难以有效区分B、C型。

针对B、C基因型样本，该实验数据显示能有效区分出8种HBV基因型（A～H）的28种型间组合中的13种组合形式，虽然B、D基因型之间只有6个碱基差异，也能被区分出来，从而证实该标签序列位置的序列具有分型特征，能特异性地鉴定出B和C基因型，同时也说明建立在大量已知序列上的生物信息学分析结果是可靠的。由于缺乏其他型的样本，未能一一验证，但其他14种组合形式的差异均大于6个碱基（除F与H型外），在理论上也是可以区分的。总体上讲，生物信息分析结果与实验结果在很大程度上彼此相互印证了该标签位置序列具有很强的型间特异性。

讨    论

以往对HBV分型主要是按血清型来分型，然而，鉴定血清型并不能很好反映HBV的基因型差异[7]；也有DNA酶切片段长度多态性分型方法，仍然由于HBV的突变特性导致谱型一致性差，难以准确鉴别[8]。随着基因组学与生物信息学的发展，以及HBV全基因组数据的积累，从基因组序列角度来分型更为准确。虽然，从全基因组或较长片段区域序列，根据变异度大于8%进行分型[9]，或者利用多重排列，并结合参考序列绘制进化树进行分型，但是，由于测序成本高，测序流程相对复杂，临床大量样本的的测序检测能力有限，所以利用特异性的型间标记进行分子生物学检测是一种快速而准确分型的有效手段。然而，由于HBV的点突变很活跃，HBV核酸序列的变异较大，因此寻找分型标签具有一定的难度。

目前国内常用的HBV分型探针主要是取自于前C区，只能区分基因型A～F，而各型探针的差异碱基数仅3～5个[3]，特异性受到一定限制，分型效果不佳。然而，近年来在该方面的研究尚无新进展。

由于HBV基因组的大S区域是该病毒最大的基因重叠区域，在第一和第二阅读框中分别编码了S基因和P基因，该区域较其他区域不易发生缺失突变，而且点突变也受两个基因的双重限制[10]。因此，大S区域的反复突变的概率相对其他非重叠基因区域要小，这些位点相对稳定，是寻找分型标记的理想区域[11]。

我们对大S区域序列进行SNP分析，从这些位点在序列上的分布来看，半数集中于序列前半部分，所以从特异性位点较为集中的区域来寻找合适的特异性标签序列成为可能。按此策略，通过基因型一致序列进行比较，我们锁定了大S区域的149～169nt和461～483nt两段序列作为特异性位点标签序列。实验结果提示，A～H 8个基因型的该组序列标签特异性很高，相对于传统的分型方法，更能有效地进行HBV基因分型，但鉴别基因型F与H尚需另外的标签。此外，虽然由于点突变的存在，并不能达到100%的分型检出，但是该两段区域作为序列标签在理论上已经达到极佳的分型效果。在应用方面，该两区段的序列标签不仅可用做引物序列、探针序列，也可作为测序标签等来进行HBV分型鉴定。

志谢    本课题受解放军第三二四医院院管课题部分资助

参  考  文  献

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