【关键词】干细胞； 肝炎，乙型； 肝炎，重型 Stem cells therapy and severe acute exacerbation of chronic hepatitis B LIU Feng, CHEN Hong-song, WEI Lai. 【Key words】Stem cells; Hepatitis B; Hepatitis, severe 【First author’s address】Hepatology Institute, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China Corresponding author: WEI Lai, Email: weelai@163.com 重型乙型肝炎是感染HBV后导致的重型肝炎，其发病凶险，进展迅速，绝大部分患者预后不良，可迅速出现大面积肝细胞坏死导致肝功能严重受损，引起各种并发症而死亡。目前临床上缺乏有效的治疗手段，主要是血浆置换和肝移植，但由于供体缺乏，很多患者在等待移植供体期间死亡。因此，及时有效的肝功能支持和促进肝细胞再生可能帮助肝功能衰竭患者无需肝移植而自行恢复或者度过等待移植的难关。近年来随着细胞生物学尤其是干细胞生物学的迅速发展，细胞治疗在基础研究领域取得了很大进展，也为重型肝炎的治疗带来了新的曙光。 细胞治疗是指将干细胞或由其分化产生的功能细胞植入病变部位以代偿病变细胞丧失的功能，或将细胞经体外遗传技术操作后用于疾病治疗的方法。自肝细胞移植治疗技术发展以来，治疗细胞从最初的同种异体成熟肝细胞，发展到异种肝细胞、胎肝细胞、肝干细胞、骨髓干细胞、脐血干细胞和胚胎干细胞。其中肝内干细胞因取材困难、分离培养复杂而难以广泛应用；胎肝细胞和胚胎干细胞由于流产胚胎的来源涉及伦理学等问题，限制其广泛应用。骨髓干细胞和脐血干细胞来源充足，增殖能力强，在体内外均有极强的向肝系细胞分化的能力，优于以上其他来源细胞，最有希望用于细胞移植以治疗肝病。 1. 肝细胞治疗：肝细胞移植有如下优点：(1) 创伤小、操作简单安全；(2) 可重复移植，一肝多用，且肝细胞可冻存；(3) 肝细胞抗原性低于器官移植，排斥反应弱；(4) 植入肝细胞能较快的发挥作用。国外20世纪70年代末开始肝细胞移植的基础研究，目前己积累了丰富的经验，有望暂时替代衰竭肝脏功能，甚至可部分替代肝移植而广泛应用于临床[1-3]。各种动物实验及临床应用表明肝细胞增殖能力强，移植肝细胞能在受体内表达正常肝功能，或在受体肝内增殖，少量肝细胞移植获得暂时的肝功能支持，并可不同程度地改善重型肝炎时肝性脑病的症状，降低血清血氨及总胆红素水平。国内在肝细胞移植研究方面虽然起步较晚，但在肝细胞的分离和培养、肝细胞永生化，及肝功能衰竭动物实验和临床研究方面也取得了一些可喜的成果。杨永平等[4]为7例重型肝炎患者实施了肝细胞脾内移植手术，观察到肝细胞能够在脾脏内增殖分化、替代或部分恢复肝脏的合成、解毒和代谢功能。虽然肝细胞移植在急性肝功能衰竭方面的疗效值得肯定，但肝细胞来源有限，且体外培养增殖困难，限制了其广泛开展。目前能够完全满足肝细胞移植需要的细胞来源正在研究中，这些供选择的细胞可能是异基因的初级细胞、人类肿瘤细胞、永生化肝细胞或干细胞。 2. 骨髓源干细胞治疗：骨髓来源的干细胞不仅具有高度增殖、多向性分化的特性和体外操作的可行性，更重要的是它来源于同种或自体，可避免排斥反应，是目前重型肝炎细胞移植研究中最多的种子细胞。骨髓源干细胞包括造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）、间充质干细胞(mesench ymal stem cells，MSCs)、内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)。HSCs是研究和临床应用最早的成体干细胞，是所有血细胞的原始起源细胞，有多种特异的表面标志分子，如CD34、CD38、c-kit等，研究者常用这些标志分子通过免疫磁珠、流式细胞术来分离纯化细胞。MSCs是骨髓基质中主要的干细胞，定居在骨髓及其他组织，参与基质微环境的组成和造血功能的调控，其表面抗原具有非专一性，可表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的标志分子，其特性稳定，连续传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能，体外扩增容易。另外，MSCs还可以通过分泌的因子调节机体的免疫功能，这些特性可能使其最先在重型肝炎的治疗中应用。 动物实验与临床研究结果都表明骨髓HSCs可分化为肝细胞，参与肝再生。1999年，Petersen等[5]报道肝脏内存在来源于骨髓的肝细胞。Alison等[6]用性别交叉移植实验和Y染色体原位杂交技术发现了小鼠和人类的骨髓细胞向肝细胞转化的现象。而对于这些细胞的功能问题，Lagasse等[7]将纯化的正常成年小鼠HSCs移植治疗FAH缺陷小鼠Ⅰ型酪氨酸蛋白血症，观察到仅需50个HSCs就能在外周血、脾、骨髓和肝脏内不断增殖并纠正肝酶代谢异常。 肝细胞生长因子（HGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子（TGF）、白细胞介素 (IL) -6、肿瘤坏死因子（TNF）等在肝脏的发育和再生过程中起重要作用，单独和联合应用会在体外诱导骨髓干细胞增殖并向肝系细胞分化。Oh等[8]将HGF应用于体外诱导骨髓干细胞向肝系细胞转化，并在诱导后的细胞中检测到甲胎蛋白、白蛋白、细胞角蛋白（CK）8和CKl8、c-met等肝系细胞的标志分子，说明HGF可作为体外诱导骨髓MSCs向肝系细胞转化的诱导因子。Schwartz等[9]从人、大鼠、小鼠骨髓中分离出MSCs，在培养体系中加入FGF4、HGF等生长因子诱导后，得到与Oh等[8]同样的结果。目前对骨髓干细胞的研究仅仅是证实了它的存在、多向分化潜能和强大的增殖能力，但对分化调控的机制、以及分离方法和培养技术的标准化等问题都有待于进一步研究。 骨髓干细胞治疗人类重型肝病的临床研究报道较少，自2005年am Esch等[10]发表了应用自体CDl33+骨髓干细胞回输促进肝细胞再生的临床报道以来，国内外陆续有十余篇文章报道了骨髓干细胞治疗肝病的临床应用结果，并且MSCs已进入Ⅱ期临床试验[11]。这些研究结果初步表明骨髓干细胞治疗的确能够改善部分患者的肝功能，但存在纳入病例数少、缺乏对照、使用的细胞类型不同、结果评价指标也不尽相同等局限性，要确认这种疗效需要更为精密和大量的实验数据支持。 3. 脐血干细胞及其移植：新生儿脐血富含干细胞，与其他来源的干细胞相比，脐血干细胞有其自身的优点：(1) 采集过程简单容易，来源丰富，对孕妇和婴儿无任何痛苦和风险；(2) 易于储存，选择相和供体时间短，可用于自身或异体；(3) 脐血干细胞免疫系统功能不健全，抗原性弱，免疫排斥反应发生率低，程度轻；(4) 移植费用低，移植成功率高。目前国内外关于脐血干细胞在肝病领域的研究多集中在体外诱导脐血干细胞向肝细胞分化方面和相关动物实验，临床应用较少。 研究结果表明，通过添加几种生长因子，脐血干细胞可以被诱导分化成为有功能的肝系细胞，并且表达肝细胞相关的标记分子。目前常用于诱导分化的生长因子包括FGF、干细胞因子（stem cell factor, SCF）、HGF等，其中以HGF最为重要。Wang等[12]证实在含有硬化的肝贮脂细胞和HGF的饲养层培养条件下可诱导脐血来源的β 唐晓鹏等[14]开展了脐血细胞移植治疗重型肝炎患者的临床应用，发现脐血细胞在降低重型肝炎患者血清总胆红素及ALT水平，升高血小板、白蛋白及胆碱脂酶活力，缩短凝血酶原时间，降低重型肝炎患者的病死率等方面，均明显优于成人鲜血。但脐带血移植同样存在一些问题：单份脐血所含造血干细胞数量少，且脐带血中淋巴细胞不成熟导致移植后造血重建延迟及移植失败，移植相关病死率高；存在传播遗传性疾病的可能。 4. 目前的工作进展：本课题组正是考虑到骨髓源干细胞种类多、取材方便，取自体可以避免免疫排斥反应等问题。从骨髓源干细胞来探讨其对乙型重型肝炎的治疗作用。EPCs是血管内皮细胞的前体细胞，又称为成血管细胞，是一群具有游走特征、能够自我更新和增殖分化的定向干细胞。在缺血性疾病中，内源性或移植外源性EPCs可能对成熟个体的新生血管形成有所帮助，并进一步改善器官的功能。我们考虑到在重型肝炎的发生时，不仅涉及肝实质细胞坏死的问题，也涉及肝内缺血的问题，因此，研究了骨髓EPCs在肝损伤发生时，参与肝血管重建进而促进肝脏损伤修复的可能性。发现在终末期肝损伤大鼠模型中，回输的大鼠EPCs在肝内可分化为内皮细胞，主要沿汇管区和纤维间隔血管壁分布，并且改善了肝功能，肝损伤减轻，肝细胞增生明显，纤维间隔变细、减少，表明EPCs可以减轻肝损伤，缓解肝纤维化[15]。提示对重型肝炎的治疗，不仅可以从直接向实质细胞—肝细胞分化的干细胞考虑，而且也可以从改善微环境的非实质细胞考虑。 5. 下一步的工作：虽然多项干细胞移植治疗肝病患者的临床研究结果鼓舞人心，但同时有许多相关问题亟需解决，应切实做好基础研究工作。如究竟哪种干细胞更适合于移植治疗，是否将各种细胞联合起来移植可以达到扬长避短的效果，干细胞的移植数量、途径和时机等问题还待探讨。本课题组在下一步的研究中将进一步完善体内实验，从HSCs、MSCs和EPCs中选择最佳的治疗用骨髓源干细胞，并对合适的干细胞数量和移植路径进行分析，同时完善干细胞的采集、培养和移植标准。建立质量控制体系和标准，最终达到临床前试验水平。 参 考 文 献 [1]Mito M, Ebata H, Kusano M, et al. 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