微生态制剂对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏自然杀伤T淋巴细胞功能的影响

【关键词】  脂肪肝； 大鼠； 微生态制剂

Effect of microbial pharmaceutics on the function of NKT cells in rats with non-alcoholic steatohepatitis    ZHAO Cai-yan, WANG Xiao-jing, ZHOU Jun-ying, YIN Hong-zhu, WANG Ya-dong, WANG Wei, LI Ya.

【Key words】     Fatty liver;    Rats;    Microbial pharmaceutics

【First author抯 address】   Department of Infectious Diseases, Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang  050051, China

Email: zhaocy2005@163.com

本研究旨在探讨肝脏自然杀伤T淋巴细胞（natural killer T cells, NKT细胞）细胞免疫功能异常在非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis, NASH）组织病理学变化中的作用及对微生态制剂的影响，以期为了解NASH的发病机制及寻找有效的治疗药物提供依据。

一、材料与方法

1.材料: 健康雄性Wistar大鼠由河北医科大学动物实验中心提供；大鼠白细胞介素12（IL-12）、肿瘤坏死因子（TNF）α、酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒均购自上海蓝基生物科技有限公司；纯化兔多克隆抗体趋化因子CXC配体16（CXCL16）购自北京博奥森生物技术有限公司；藻红蛋白标记的CD3抗体购自美国eBioscience公司；异硫氰酸荧光素标记的小鼠抗大鼠 CD161抗体购自美国USBiological公司；AMV反转录试剂盒购自美国Promega公司；CXCL16、CD1d、β-肌动蛋白序列依据基因库设计，由北京赛百盛基因技术有限公司合成；双歧杆菌乳杆菌三联活菌（批号：S19980004）购自内蒙古双奇药业股份有限公司。

2. 动物模型的建立和标本的制备：雄性Wistar大鼠18只，体质量（150±10）g，适应性喂养1周后，随机分为：(1)正常组6只，基础饲料喂养至第16周末实验结束；(2) 治疗组6只，用高脂饲料（83%基础饲料＋2%胆固醇＋10%猪油＋5%玉米油）喂养，并于第12周末在继续喂养高脂饲料的基础上，以400mg.kg-1.d-1的双歧杆菌乳杆菌三联活菌用等渗盐水溶解后灌胃；（3）模型组6只，用上述高脂饲料喂养至第12周末，在继续喂养高脂饲料的基础上给予与治疗组等容积的等渗盐水灌胃。第16周末隔夜空腹处死所有大鼠并留取标本。

3. 血清指标的测定：用日本奥林巴斯AU 2700全自动生物化学分析仪测定血清总胆固醇、甘油三酯、ALT、AST， IL-12与TNFα用ELISA检测，血浆内毒素用鲎试剂显色基质法进行测定，严格按照说明进行操作。

4. 病理学检查：用4%甲醛固定肝组织标本，石蜡包埋切片，常规HE染色，观察肝组织炎症和细胞病变程度；用Masson三重染色观察肝组织纤维化程度。新鲜肝组织于-20℃快速冰冻切片行苏丹Ⅳ染色观察肝细胞脂肪变的程度。

5. 肝脏NKT细胞的检测：取大鼠肝组织剪碎后研磨，经120目、100目重叠的尼龙网过滤，离心，置于2ml 40%的大鼠percoll淋巴细胞分离液之下，再次离心。收集交界面处的淋巴细胞层细胞。再分别加入藻红蛋白标记的抗大鼠CD3、异硫氰酸荧光素标记的抗大鼠自然杀伤细胞受体蛋白1A，避光孵育1h后，用流式细胞仪检测。

6. CD1d mRNA、CXCL16 mRNA表达的测定：用RT-PCR法检测，先用Trizol一步法提取肝组织总RNA，以随机引物逆转录合成cDNA，以适量cDNA为模板，以β-肌动蛋白为内参照（扩增产物228bp），PCR扩增CD1d mRNA、CXCL16 mRNA基因片段。CD1d mRNA引物上游为5′- TAGAGGGGCAGGACATCATC-3′，下游为5′-AGGAGAGGCAGGGGTAAAAA-3′，片段长度为173bp；CXCL16上游为5′-GCAAAAAGAACCAGGAGCTG-3′，下游为5′-CCACCTCTCCCACATCATCT-3′，片段长度为227bp；β-肌动蛋白上游为5′-AGCCATGTACGTAG CCATCC-3′，下游为5′-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3′，片段长度为228bp。PCR反应参数：94℃ 5min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环，最后72℃ 5min。PCR产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，显色成像用BIO-PROFIF图像分析系统进行吸光度扫描，以各组β-肌动蛋白条带的扫描值为标准，计算CD1d mRNA、CXCL16 mRNA的表达量。

7. CXCL16蛋白表达的测定：用Power Envision免疫组织化学两步法测定。石蜡切片脱蜡至水，高压修复，3%过氧化氢室温孵育25min，以封闭非特异性抗原；滴加1∶100 CXCL16抗体，4℃过夜；滴加第二抗体IgG，37℃孵育30min；DAB显色。以0.01mol/L磷酸盐缓冲液代替第一抗体作为空白对照。结果判定标准为细胞质呈棕黄色为阳性细胞。用多功能病理图像分析仪定量分析。

8. 统计学方法：所有数据用均数±标准差（x-±s）表示，采用单因素方差分析进行组间比较，相关性分析用直线相关分析法，P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1. 血清学指标检测结果：模型组血总胆固醇、甘油三酯、ALT、AST、内毒素、IL-12 及TNFα水平均高于正常组，而治疗组上述指标均有下降，见表1。

2. 肝组织病理学变化：正常组大鼠肝脏为红褐色，质软，有弹性；模型组肝脏明显增大，浅黄色，切面油腻感；治疗组肝脏外观介于对照组和模型组之间。光镜下观察，正常组大鼠肝细胞索以肝小叶中央静脉为中心呈放射状整齐排列。模型组肝细胞索结构紊乱，小叶内散在肝细胞点、灶性坏死，炎性细胞浸润。模型组肝组织苏丹Ⅳ染色示中央静脉周围、汇管区肝细胞内均充满粉红色脂滴，Masson染色可见汇管区扩大，肝窦周围胶原纤维沉积；治疗组肝组织炎症细胞浸润明显减轻；肝细胞内粉红色脂滴明显减少，见图1。

3.流式细胞仪检测肝脏NKT细胞的结果：模型组肝脏NKT细胞（8.31%±3.81%）较正常组（22.95%±2.65%）下降（P＜0.01），治疗组肝脏NKT细胞（16.90%±1.96%）较模型组升高（P＜0.01），见表2。

4. 肝组织CD1d mRNA、CXCL16 mRNA和蛋白表达变化：CD1d mRNA：模型组肝组织CD1d mRNA表达较正常组下降（P＜0.01），治疗组CD1d mRNA 较模型组显著升高（P＜0.01，表2，图2）。CXCL16：模型组肝组织CXCL16 mRNA 和蛋白的表达均较正常组升高（P＜0.01），治疗组CXCL16 mRNA和蛋白的表达均较模型组降低（P＜0.01，表2，图2，3）。

5. 相关分析结果：肝组织CD1d mRNA表达与肝脏NKT细胞含量呈直线相关，回归方程为Y＝-0.185+ 0.658X，r＝0.800，P＜0.01；肝组织NKT细胞与血清IL-12水平、肝组织CXCL16蛋白含量呈负相关，回归方程分别为Y＝91.463-257.275X，Y＝33.135-133.749X，r值分别为-0.759、-0.809，P值均＜0.01。

三、讨论

本研究结果表明，高脂饮食诱导的NASH大鼠肝组织CD1d表达下调，CD1d依赖性NKT细胞也随之减少、功能失调，调节Th0向Th1型细胞分化，TNFα、IL-12释放增加。其原因可能为NASH肝细胞存在内质网应激，调节CD1d分子在肝细胞膜上表达减少[1]。枯否细胞释放的内源性IL-12的增加，IL-12 p40转化为IL-12 p70和IL-23异二聚体与NKT细胞相互作用，介导NKT细胞凋亡，使NKT细胞存活能力下降，CD1d依赖性NKT细胞凋亡数目增多，存活的NKT细胞数目减少[2]。IL-12又可通过JAK-STAT信号途径来直接激活Th1型细胞因子应答的靶基因，最终促进TNFα等Th1型细胞因子表达增加。这些促炎细胞因子又可进一步促进NKT细胞凋亡、Th1型促炎细胞因子的释放，形成恶性循环。持续的促炎环境进一步促进NASH的发生和发展。

NASH的发展与外周淋巴细胞向肝组织炎症部位的迁移和募集密切相关。CXCL16是趋化因子家族中的新成员，其可表达于炎症的肝组织。CXCR6是CXCL16的受体，主要在NKT细胞、CD4+ Th1和CD8+ T淋巴细胞上表达, 表达CXCR6阳性的淋巴细胞被CXCL16选择性地趋化。CXCR6/CXCL16相互作用在外周淋巴细胞定向迁移至肝脏炎症部位中发挥了关键作用。Xu等[3]发现，肝组织中CXCL16的表达上调与血清ALT水平、致炎物质和凋亡分子的产生以及组织浸润的淋巴细胞数量密切相关。应用CXCL16中和抗体阻断可明显降低肝损伤、抑制促炎因子的产生、减少淋巴细胞尤其是CXCR6阳性T淋巴细胞的浸润。另外，CXCR6/CXCL16之间的相互作用不仅可调节NKT细胞的活化和稳态，而且还在NKT细胞介导的Th1型免疫应答中发挥重要的作用[4]。本研究结果显示，NASH大鼠肝组织大量淋巴细胞浸润、肝脏损伤明显，可能与CXCL16显著上调及介导Th1细胞因子的释放有关。由此推断，CXCL16在趋化免疫细胞到炎症部位参与肝脏免疫调节和免疫病理反应的过程中可能发挥了重要的作用。

参  考  文  献

[1]Yang L, Jhaveri R, Huang J, et al. Endoplasmic reticulum stress,hepatocyte CD1d and NKT cell abnormalities in murine fatty livers.Lab Invest, 2007, 87: 927-937.

[2]Olleros ML, Martin ML, Vesin D, et al. Fat diet and alcohol-induced steatohepatitis after LPS challenge in mice:role of bioactive TNF and Th1 type cytokines. Cytokine, 2008, 44: 118-125.

[3]Xu HB, Gong YP, Cheng J, et al. CXCL16 participates in pathogenesis of immunological liver injury by regulating T lymphocyte infiltration in liver tissue. World J Gastroenterol, 2005, 11: 4979-4985.

[4]Germanov E, Veinotte L, Cullen R, et al. Critical role for the chemokine receptor CXCR6 in homeostasis and activation of CD1d-restricted NKT cells. J Immunol, 2008, 181: 81-91.

（收稿日期：2010-06-28）

（本文编辑：孙宇航）

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