乙型肝炎病毒干预后小鼠肝脏树突状细胞p干扰素调节因子3表达的研究

【摘要】  目的  研究HBV干预后小鼠肝脏树突状细胞p-干扰素调节因子3及其下游Ⅰ型干扰素表达的变化。 方法  用免疫磁珠分选法分离肝脏树突状细胞，并用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4在24孔板中诱导培养。用超离心技术获得HBV，并用实时荧光定量PCR检测。第5天将培养的树突状细胞分为2组：HBV组与HBV共同培养，对照组加入等量的细胞培养液。24h后，两组均加入聚肌胞刺激，收集0、1、2、6、24h的细胞和上清液，用Western blot检测p-干扰素调节因子3的表达情况，用酶联免疫吸附法检测上清液中干扰素β的浓度。组间比较用t检验。 结果  0h时HBV组培养液上清液干扰素β浓度［（12.38±3.71）pg/ml］与对照组［（10.83±4.11）pg/ml］比较，差异无统计学意义（P>0.05）。聚肌胞刺激后6h，HBV组培养液上清液干扰素β浓度［（88.67±9.01）pg/ml］与对照组［（137.68±12.28）pg/ml］比较，t＝9.653，P＜0.01，差异有统计学意义。聚肌胞刺激后24h，HBV组培养液上清液干扰素β浓度［（69.89±5.80）pg/ml］与对照组［（72.25±8.61）pg/ml］比较，差异无统计学意义（P>0.05）。聚肌胞刺激小鼠肝脏树突状细胞后p-干扰素调节因子3表达逐渐增强。经HBV干预在感染时病毒与细胞数量的比值为25，24h后再用聚肌胞刺激2h，HBV组p-干扰素调节因子3表达较对照组减弱。 结论  HBV干预后小鼠肝脏树突状细胞p-干扰素调节因子3及其下游Ⅰ型干扰素表达均下调。

【关键词】  肝炎病毒, 乙型； 聚肌胞苷酸；小鼠； 树突细胞； 干扰素类

Study on type I interferon and phospho-IRF3 in murine liver dendritic cells after intervened by HBV    ZHENG Jian-ming, SHI Guang-feng, LI Ning, QIAN Zhi-ping, ZHU Meng-qi, CHEN Ming-quan, LI Qian, WANG Xin-yu. Department of Infectious Diseases, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China

Corresponding author: SHI Guang-feng, Email: gfshi@shmu.edu.cn

【Abstract】    Objective    To detect the secretions of type I interferon and the expressions of phospho-IRF3 in murine liver dendritic cells intervened by HBV. Methods    The murine liver dendritic cells were isolated via anti-CD11c microbeads  and were incubated in the presence of GM-CSF and IL-4 to induce the DC generation and proliferation in 24-well cell culture plates. HBV virions were isolated via ultracentrifugation and were detected by quantitative Realtime-PCR. The DCs were divided into two groups: one group was cultured with HBV virions for 24 hours, the other group was cultured without HBV as control group. The cells were harvested at 0h, 1h, 2h, 6h and 24h after being stimulated with poly I:C and the expressions of p-IRF3 and the concentration of IFNβ in supernatants were detected with western blot and ELISA respectively. Results   The IFNβ concentrations at 0 h, 6 h and 24 h in the supernatants of the HBV group and the control group were (12.38±3.71) pg/ml, (88.67±9.01) pg/ml and (69.89±5.80) pg/ml vs (10.83±4.11) pg/ml, (137.68±12.28) pg/ml and (72.25±8.61) pg/ml, respectively. No statistical differences found at 0 h (t = 0.8398, P > 0.05) and 24 h (t = 0.6820, P > 0.05) between the two groups except that at 6 h (t = 9.653, P < 0.01). The expressions of phospho-IRF3 in HBV group were lower than that in control group. Conclusions    The type I interferon secretion and the phospho-IRF3 expression were decreased in murine liver dendritic cells when intervened by HBV.

【Key words】     Hepatitis B virus;    Poly I:C;   Mice;    Dendritic cells;    Interferons

我们前期的研究结果显示慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞来源的树突状细胞存在表型变化和功能障碍，用聚肌胞（polyinosinic polycytidylic acid, poly I∶C）刺激后，Toll样受体（toll-like receptor, TLR)3的表达和分泌干扰素 (IFN)β的水平较健康对照组低，可能与HBV持续感染相关[1-4]。Wu等[5]发现HBV能抑制TLR介导的鼠肝脏枯否细胞和窦状内皮细胞的天然免疫应答。本研究中，我们观察了HBV干预后小鼠肝脏树突状细胞干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3, IRF3）及其下游Ⅰ型干扰素的表达变化，探讨HBV持续感染的免疫学机制，现报道如下。

材料与方法

一、材料

1. 实验动物：8～10周龄雄性清洁级C57BL/6小鼠110只，体质量20～25g，购自复旦大学上海医学院动物实验中心。

2. 主要试剂：RPIM1640培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司；鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、鼠白细胞介素4、CD11c磁珠和磁柱均购自德国美天旎公司；Percoll分层液和poly I∶C均购自美国Sigma公司；酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒购自美国Antigenix公司；鼠β-肌动蛋白抗体购自美国Santa Cruz公司；兔抗鼠p-IRF3抗体购自美国cell signaling公司；离心管、移液管和100μm细胞过滤网均购自美国BD公司；HBV PCR试剂盒购自上海科华检验医学产品有限公司；红细胞裂解液由中国科学院上海巴斯德研究所肿瘤病毒研究组邓强副研究员惠赠；HBV从HepAD38细胞上清液超速离心获得；HepAD38细胞由中国科学院上海巴斯德研究所肿瘤病毒组蓝柯研究员惠赠。

3. 主要仪器:生物安全柜购自美国热电公司；艾本德5810R冷冻离心机购自德国艾本德公司；超速离心机购自美国贝克曼公司；TE2000-S倒置显微镜购自日本尼康公司；80i正置显微镜购自日本尼康公司；4℃、-20℃冰箱均购自中国海尔公司；HEPA CLASS100二氧化碳孵育箱购自美国热电公司；-80℃低温冰箱购自美国Copedland公司；细胞磁珠分离系统购自德国美天旎公司；7900HT定量PCR仪购自美国ABI公司。

二、方法

1. 小鼠肝脏树突状细胞的分离和培养：（1）小鼠肝细胞悬液的制备：用颈椎脱臼法处死小鼠，并用75%乙醇浸泡5min后取出固定四肢，打开腹腔暴露肝脏及门静脉。用7号输液针与20ml注射器排气后经门静脉穿刺插管固定。用37℃预热的磷酸盐缓冲液（PBS）进行原位肝脏灌注，待肝脏膨起并呈白色，剪断下腔静脉放血。取出肝脏并用PBS漂洗去除肝脏表面的血渍。于冰上预冷的培养皿中剪碎肝组织，用100μm细胞过滤网过滤，所得悬液即为肝细胞悬液。（2）Percoll分层液单密度梯度离心纯化小鼠原代肝细胞悬液:用PBS配制40%的Percoll分层液。将肝细胞悬液铺在40% Percoll分层液上，体积比例为1∶1。2600r/min离心20min，取出后分4层，吸至剩下最后一层。用10ml的RPIM 1640培养基洗涤，1500r/min离心5min。加入1ml红细胞裂解液，冰上5min。加入10ml的RPIM 1640培养基洗涤2次。吸取10μl并和同体积锥虫蓝混合后计数。（3）免疫磁珠法分离小鼠肝脏树突状细胞：按免疫磁珠说明书操作。按每l×107个细胞用80μl磁珠分离液重悬细胞，并加入20μl CD11c磁珠的比例操作，4℃孵育15min，经细胞磁性分离系统阳性分选CD11c阳性细胞。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度为4×105个/ml，置于24孔板中培养。（4）小鼠肝脏树突状细胞的培养：每孔加入鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子和鼠白细胞介素4，调整浓度均为l000U/ml，置于37℃，体积分数5%的CO2孵箱培养。隔日半量换液，并补充细胞因子。第5天，将细胞分2组，一组加入含HBV的培养液作为HBV组，细胞上清液中病毒浓度为1×107拷贝/ml，另一组加入等量细胞培养液作为对照组。共培养24h后，加入polyI∶C使终浓度为50μg/ml，收集不同时间点的细胞和上清液。收集的细胞加蛋白裂解液煮沸15min后与上清液一起贮存在-20℃冰箱，备下一步检测用。

2. HBV的纯化：收集含HBV的HepAD38细胞培养液上清液，铺在20%蔗糖溶液，25000r/min，12℃超速离心16h，分离得到HBV，溶于PBS后，贮存在-80℃冰箱，备与树突状细胞共培养用。

3. HBV DNA浓度的检测:按HBV PCR试剂盒说明书，用实时荧光定量PCR的方法，检测溶液中HBV的浓度。为避免超速离心的病毒浓度可能超过试剂盒的线性检测范围，故将病毒溶液稀释成不同浓度梯度进行检测，取检测的平均值。

4. ELISA检测：将收集的培养上清液标本自 -20℃低温冰箱取出，置于冰上融化，再放于室温平衡，按照小鼠IFNβ ELISA试剂盒说明书经加样，室温孵育，加第二抗体，再次室温孵育，洗板，加显色底物，室温避光孵育15min，最后加入终止液终止反应，并用酶标仪在450nm处检测吸光度值。

5. Western blot检测：配制8%聚丙烯酰氨凝胶电泳胶，然后在样品槽中加入40μl制备好样品。初始电泳在90V电压下进行，待前沿指示剂进入分离胶后，将电压调至120V继续电泳，待前沿指示剂到达分离胶下沿时，停止电泳。转膜，取上述胶板和硝酸纤维素膜装成“三明治”结构，放入转移电泳槽中，于4℃，300mA恒流，电转移90min。用PBS/吐温20洗涤硝酸纤维素膜3次，每次5min，后加第一抗体1∶1000，孵育1h。用PBS/吐温20洗涤硝酸纤维素膜3次，每次5min，加第二抗体（碱性磷酸酶标记抗体）1∶1000孵育1h。用PBS/吐温20洗涤硝酸纤维素膜3次，每次5min，后加显色液避光显色15min，用扫描仪扫描显色带。

6. 统计学方法：数据以均数±标准差（x-±s）表示。用SPSS11.0统计学软件进行统计学分析，组间比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. HBV DNA浓度检测结果:PCR荧光探针法检测的标准曲线方程为Y＝-3.194X＋40.864，R2＝0.9891，HBV DNA最高浓度为1.4×1010拷贝/ml，满足实验要求。

2. HBV干预后小鼠肝脏树突状细胞IFNβ的表达：ELISA法检测IFNβ标准曲线方程为Y＝0.004534X－0.006684，R2＝0.9939。0h时HBV组培养液上清液IFNβ浓度为（12.38±3.71）pg/ml与对照组的（10.83±4.11）pg/ml比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Poly I∶C刺激后6h，HBV组培养液上清液IFNβ浓度为（88.67±9.01）pg/ml与对照组的（137.68±12.28）pg/ml比较，t＝9.653，P＜0.01,差异有统计学意义。Poly I∶C刺激后24h，HBV组培养液上清液IFNβ浓度为（69.89±5.80）pg/ml与对照组的（72.25±8.61） pg/ml比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

3. HBV干预后小鼠肝脏树突状细胞p-IRF3的表达变化：用poly I∶C刺激小鼠肝脏树突状细胞，p-IRF3表达逐渐增强，2h表达较强，后逐渐减弱。经HBV干预，感染时病毒与细胞数量的比值为25，24h后再用poly I∶C刺激2h，HBV组p-IRF3表达较对照组弱，见图1，2。

讨    论

HBV感染后致病机制复杂，引起持续感染的免疫学机制尚未阐明。有研究表明，慢性乙型肝炎患者体内功能最为强大的专职抗原提呈细胞树突状细胞的成熟障碍，功能下调，不能及时有效启动针对性的适应性免疫应答，最终导致细胞毒T淋巴细胞反应弱，造成体内受染细胞对高滴度HBV含量的耐受状态，是导致HBV持续感染的主要机制[6]。

树突状细胞是通过模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）识别病原微生物，分泌Ⅰ型干扰素等细胞因子，介导并激活适应性免疫应答。不同的PRRs通过不同的信号转导通路激活免疫应答。TLR是PRRs的重要组成部分，TLR3、4、7、8、9与病毒感染有关，可以分泌Ⅰ型干扰素[7-8]。其中，TLR3和TLR4是通过IRF3信号通路分泌IFNβ，而TLR7、8、9是通过IRF7信号通路分泌IFNα[9-10]。本研究选择IFNβ及其上游IRF3作为研究对象，结果显示HBV干预后正常肝脏树突状细胞IRF3的表达和IFNβ的分泌降低，提示可能是因为HBV抑制正常肝脏树突状细胞功能导致HBV持续感染。

本研究结果显示HBV干预后正常肝脏树突状细胞IRF3的表达降低，与安宝燕等[11]用poly I∶C刺激外周血单个核细胞来源的树突状细胞，慢性乙型肝炎患者组中IRF3 mRNA的表达上升不明显，而健康对照组单个核细胞来源的树突状细胞中IRF3 mRNA表达水平明显升高的结果一致，提示HBV能抑制肝脏树突状细胞IRF3表达，这可能与HBV持续感染有关。

Wu等[5]发现HBV能抑制TLR介导的鼠肝脏枯否细胞和窦状内皮细胞的天然免疫应答。本研究在小鼠肝脏树突状细胞上也发现HBV干预后正常肝脏树突状细胞IRF3的表达及其下游IFNβ的分泌降低，提示天然免疫应答受到抑制，与其研究结果一致。

信号通路中分子的相互作用十分复杂，本研究只是观察HBV对I型干扰素信号通路中一部分环节的影响，由于IRF3上游PRRs除了我们前期研究的TLR3，还有TLR4、视黄醇诱导基因-Ⅰ、黑色素瘤分化相关基因5、DNA依赖激活的干扰素调节因子等PRRs也是通过IRF3信号通路[12-14]，信号通路与IRF3处类似位置的其它分子，如IRF7、核因子κB、细胞外信号调节激酶等，以及IFNα信号通路的情况，还有待进一步研究。

志谢  本研究得到中国科学院上海巴斯德研究所肿瘤病毒学研究组、蓝柯研究员及其研究组成员邓强副研究员、高原博士后、夏天博士、何之恒博士、刘云华博士、梁德光博士、李小凡博士、林先志博士、王卓博士、贾宝森博士、金毅博士、李龙江博士、赵清兰博士、余鑫等人的帮助

参  考  文  献

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陈明泉,施光峰,卢清,等.不同病毒载量的慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的表型和功能. 中华肝脏病杂志,2007,15:19-23.

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陈明泉,施光峰,李谦,等.慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞上Toll样受体的表达变化.中华传染病杂志,2007,25:719-722.

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（收稿日期：2010-08-16）

（本文编辑：孙宇航）

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