脂多糖对人外周血树突状细胞成熟的影响

【摘要】目的  通过研究内毒素的不同作用方式，模拟慢性乙型肝炎肠源性内毒素血症，探讨脂多糖（LPS）对人外周血树突状细胞(DC)成熟的影响。 方法  用重组人粒细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素-4、酪氨酸激酶受体3配体和肿瘤坏死因子α体外诱导、培养人外周血单个核细胞。分为持续刺激组：于1、4、7、9d加入LPS 1μg/ml；短期刺激组：于7、8d加入LPS 1μg/ml；对照组：不加LPS。观察细胞形态，用流式细胞仪检测细胞表型,混合淋巴细胞反应检测DC刺激T淋巴细胞的能力，用酶联免疫吸附法检测DC分泌细胞因子的水平。组间比较采用SPSS10.0统计学软件进行单因素方差分析，进一步两两比较用SNK法。 结果  DC表达人白细胞-DR抗原、CD86、CD80、CD83分子水平，持续刺激组分别为65.81%±10.96%、48.81%±18.13%、13.56%±5.48%、11.52%±5.09%，对照组分别为78.43%±20.34%、51.29%±15.75%、15.22%±5.53%、15.64%±5.26%，短期刺激组分别为89.83%±16.99%、69.90%±24.05%、25.97%±10.81%、25.96%±10.59%，持续刺激组DC表面分子表达水平低于短期刺激组和对照组，各组比较，F值分别为3.376、3.823、4.535、5.320，P值均<0.05，差异均有统计学意义。3组DC诱导同种异体混合T淋巴细胞的增殖指数分别为1.593±0.303、1.949±0.240、1.548±0.365，各组比较，F＝3.572，P＝0.049，差异有统计学意义。3组DC表达干扰素γ水平短期刺激组为（40.52±11.38）pg/ml，高于对照组和持续刺激组［分别为（21.57±7.68）pg/ml、（15.6±5.83）pg/ml］，各组比较，F＝3.403，P＝0.019，差异有统计学意义。3组DC表达白细胞介素-12水平短期刺激组为（84.45±31.28）pg/ml，高于对照组和持续刺激组［分别为（54.42±20.34）pg/ml、（51.77±11.02）pg/ml］，各组比较，F＝2.212，P＝0.088，差异有统计学意义。结论  LPS持续刺激可抑制DC的发育成熟,可能是肠源性内毒素血症患者细胞免疫功能低下的原因所在。

【关键词】树突细胞;  脂多糖类； 内毒素血症

Effects of lipopolysaccharide on the maturation and secretion of human peripheral dendritic cells    LI Hong, ZHAO Long-feng, HAO Yan-qin, HAN De-wu. Department of Infectious Diseases, First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

Email: lihong6403@ 126.com

【Abstract】 Objective    To study the effects of Lipopolysaccharide (LPS) on the maturation and secretion of human peripheral dendritic cells (DCs). Methods    DCs from healthy human perpheral monocytes (PBMCs) were induced in vitro with rhGM-CSF, rhIL-4, Flt3-L and TNFα. The subjects were divided into 3 groups: the long-term group stimulated with LPS 1μg/ml at day 1, 4, 7, 9 postculture; the short-term group stimulated with LPS 1μg/ml at day 7 and 8 postculture, and the DCs without LPS stimulation was control group. After 10 days of culture, the morphologic features of DCs were observed by light and electron microscopes, the phenotypic patterns were charactericed by flow cytometry, the proliferation of T cell were evaluated with mixed leukocytes reaction (MLR) and the levels of IL-12 and IFNγ produced by DCs were analyzed with ELISA. Results    Compared with the short-term group, the expressions of HLA-DR (65.81%±10.96%), CD86 (48.81%±18.13%), CD80 (13.56%±5.48%), CD83 (11.52%±5.09%), the secretions of IFNγ(15.60±5.83 pg/ml) and IL-12 (51.77±11.02 pg/ml) by the DCs in long-term group were decreased obviously (P < 0.05) and the proliferation of homogenic lymphcyte cells (1.548±0.365) stimulated by DCs was also impaired (P < 0.05). Conclusion    Long-term LPS stimulation can suppress the maturation and secretion of DCs, which might be the reason of poor immunity in the patients with intestinal endotoxemia.

【Key words】Dendritic cells; Lipopolysaccharides; Endotoxemia

我们在前期的临床研究中发现，慢性乙型肝炎患者长期持续患有肠源性内毒素血症（intestinal endot-oxemia，IETM）时机体的免疫功能明显降低[1]。在此基础上，我们将内毒素单独作用于体外培养的树突状细胞（DC），观察其对细胞免疫功能的影响。

材料与方法

1．实验材料: 重组人粒细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素（IL）-4、肿瘤坏死因子α、酪氨酸激酶受体3配体均购自英国PEPRO TECH公司；RPMI 1640购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；1.077g/ml淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂；荧光标记鼠抗人白细胞-DR抗原、CD80-PE、CD86-PE单克隆抗体均购自美国BD公司；白细胞介素-12、酶联免疫分析试剂盒均购自上海森雄科技实业有限公司；4，5-二甲基噻唑-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）、丝裂霉素C均购自美国Sigma公司。

2. 外周血单个核细胞的分离：采集健康人外周血15～20ml加入肝素抗凝，2h内用预温至37℃的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释1倍。在20ml离心管中加入淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝血沿管壁加在淋巴细胞分离液面上，淋巴细胞分离液与抗凝血的体积比为3∶2，以2500r/min离心25min，由上至下分出血清、单个核细胞、淋巴细胞分离液和红细胞4条带。收集界面细胞于10ml离心管中，用PBS稀释，分别以2000、1500、1000r/min离心洗涤细胞3次，洗尽血小板，弃去上清液。以无血清RPMI 1640悬浮沉淀细胞，调整细胞浓度到3×106/ml～5×106/ml，移入6孔板中，2ml/孔，置37℃、5%的CO2孵箱中贴壁2h，去除未贴壁细胞。

3. DC体外定向诱导分化和培养：按照Romani等[2]的方法，收集贴壁细胞加含15%胎牛血清的 RPMI 1640完全培养基，2ml/孔，按含重组人粒细胞集落刺激因子1000U/m、重组人白细胞介素-4 500U/ml和rh酪氨酸激酶受体3配体25ng/ml 终浓度加入细胞因子，置37℃、5% CO2孵箱中培养。每隔2d换半量培养液1次，补充重组人粒细胞集落刺激因子1000U/ml，重组人白细胞介素-4  500U/ml；培养8d补加肿瘤坏死因子α 1000U/ml，共培养9d。在培养的过程中，将细胞分为3组，施以不同的刺激条件：（1）对照组培养过程中不加脂多糖（LPS）；（2）短期刺激组培养的最后2d加入1μg/ml的LPS；（3）持续刺激组培养的全过程维持1μg/ml的LPS。

4. DC表型的检测：取培养9d的DC进行流式细胞检测，收集细胞悬液1000r/min离心5min， -20℃保存上清液备检。沉淀的细胞用PBS洗2次，用PBS制成细胞悬液，细胞数不低于5×105个/管，加入PE标记的人白细胞-DR抗原、CD80、CD86、CD83各10μl，轻轻混匀，暗处孵育45min后用PBS洗１次，重悬于500μl PBS后用流式细胞仪检测。

5. 混合淋巴细胞反应：取健康人外周血，常规分离外周血单个核细胞, 在37℃、5% CO2孵箱中培养2h，取悬浮细胞，即同种异体Ｔ淋巴细胞作为反应细胞。取培养9d的DC作为刺激细胞，用50mg/L的丝裂霉素C 37℃处置45min后，PBS洗涤2次,悬浮于含15%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中，调至细胞浓度为2×105个/ml，加入96孔培养板中，100μl/孔，用正常人的外周血单个核细胞作对照，每孔再加入浓度为2×106个/ml同种异体T细胞100μl，使终体积为200μl/孔，Ｔ细胞与DC体积比为10∶1，每组设3个复孔，37℃、5%的CO2孵箱中培养96h。培养结束后，轻轻吸出上清液，向所有孔中的沉淀细胞加入5mg/ml的MTT液20μl/孔。上述相同条件下继续培养4～6h，吸尽上清液后每孔加入150μl的二甲基亚砜溶液，振荡10min，待结晶的MTT充分溶解后，以空白孔调零，酶标仪测定吸光度值，波长为595nm。

6. 细胞因子表达水平的检测：收集培养第9、11天的上清液于-20℃保存备检，培养9d的细胞分为第3次换液对照组、第3次换液持续刺激组，检测白细胞介素-12、干扰素（IFN）γ的表达水平。酶联免疫吸附法操作步骤严格按说明书进行。

7. 统计学处理：数据以均数±标准差（x-±s）表示，组间比较采用SPSS10.0统计学软件进行单因素方差分析,进一步两两比较用SNK法，P＜0.05为差异有统计学意义。

结    果　

1．倒置显微镜观察结果：贴壁的细胞在体外经细胞因子诱导5～7d后，可见大量的悬浮细胞成簇状，体积明显增大，呈多形性。第11天可见细胞表面向四周伸展出大量毛刺样突起，呈太阳光芒状或树根状，为典型的DC形态。短期刺激组的DC突起明显。持续刺激组的DC细胞体积增大不明显，突起小而少，见图略。

2. 电子显微镜下DC的形态学改变：培养11d的DC表面粗糙，有大量的皱褶及粗细不等树枝状突起，细胞核形状不规则，核仁小，核内异染色质高度凝聚。胞质内可见大量线粒体和溶酶体，核糖体、粗面内质网丰富。持续刺激组的DC的突起较短，胞质内细胞器较少，见图2。

3．树突状细胞的免疫表型分析：短期刺激组CD86、CD80、人白细胞-DR抗原、CD83细胞因子的表达水平高于对照组与持续刺激组；对照组与持续刺激组各细胞因子表达水平比较，差异均无统计学意义，见表略。

4. LPS对DC诱导T淋巴细胞增殖能力的影响：对照组、短期刺激组、持续刺激组诱导同种异体混合T淋巴细胞的增殖指数分别为1.593±0.303、1.949±0.240、1.548±0.365，各组比较，F＝3.572，P＝0.049，差异有统计学意义。对照组与持续刺激组增殖能力比较，差异无统计学意义。

5. LPS对DC产生细胞因子的影响：短期刺激组、对照组、持续刺激组和第3次换液对照组、第3次换液持续刺激组IFNγ表达水平差异有统计学意义（P<0.05）。各组白细胞介素-12表达水平有相同趋势，见表略。

表2  各组DC细胞因子表达结果(x-±s，pg/ml)

组别       例数         干扰素γ    白细胞介素-12

第3次换液对照组       8     15.49± 6.48a       53.77±13.84a

第3次换液持续刺激组       8     11.65± 3.27a       48.52±11.13a

对照组    8     21.57± 7.68a       54.42±20.34a

短期刺激组    8     40.52±11.38  84.45±31.28

持续刺激组    8     15.60± 5.83a       51.77±11.02a

F值           3.403     2.212

P值           0.019     0.088

  注：a 与短期刺激组比较，P<0.05

讨    论

LPS是人革兰氏阴性菌的主要致病物质，在研究DC成熟的实验中，通常在DC培养的后期用LPS短期刺激，以诱导DC成熟[3]。表现为主要组织相容性复合体（MHC）-Ⅱ，共刺激分子和某些黏附分子表达增加，摄取抗原的能力降低，提呈抗原的能力增强，刺激同种异基因T细胞增殖能力提高。然而无论是患有持续严重感染还是慢性乙型肝炎等伴有内毒素血症时机体的免疫功能是低下的，持续内毒素是否仍然可以诱导DC成熟？前期临床观察发现，IETM阳性的慢性乙型肝炎患者，与IETM阴性的慢性乙型肝炎患者相比，Th1型细胞因子明显下降，而Th2型细胞因子升高[1]。可见慢性乙型肝炎患者体内长期持续存在的IETM明显降低细胞免疫功能，导致肝炎病毒难以清除。本研究将LPS作为惟一的刺激因素，模拟慢性乙型肝炎患者体内持续、小剂量的内毒素血症，作用于培养的DC，观察持续LPS刺激时DC的成熟是否受到抑制，以了解慢性乙型肝炎时DC的功能变化，发现短期刺激组DC体积明显增大，呈多形性，细胞表面向四周伸展出大量毛刺样突起，呈太阳光芒状或树根状，而持续刺激组的DC细胞体积增大不明显，突起小而少，电镜下胞膜皱褶和突起少而且圆钝，胞质中小泡很多，线粒体多，而溶酶体较少，成熟度明显降低，与Greifenberg等[4]的研究结果相近。

DC表面是否存在特异性标志,目前尚无一致意见。CD1a在多数DC表面表达,可以作为DC的相对特异性标志[5],CD83则是DC充分成熟的标志[6-7]。人白细胞-DR抗原是一种MHC-类分子，DC通过MHC-类分子与抗原肽片段结合后必须在共刺激分子（如B7-1）的协同作用下才能将抗原提呈给淋巴细胞,启动免疫应答[8]，因此CD80（B7-1）分子水平反映了作为抗原提呈细胞的DC功能的高低。我们通过流式细胞技术对不同时期LPS刺激的DC表面分子表达进行检测发现，表达于短期刺激组的DC表面的共刺激分子CD80、CD86（B7-2）、CD83及MHC-Ⅱ类分子的水平明显升高，高于对照组，而从单核细胞开始分化时即用LPS持续刺激DC，表达以上分子的水平明显低于短期刺激组。由于DC对免疫应答的启动和调节作用主要通过其表面分子，所以MHC-Ⅱ和共刺激分子等表达降低必然影响到DC功能的发挥。

抗原提呈功能是成熟DC最主要的功能，在炎症部位吞噬了抗原的未成熟DC在内源性或外源性炎症因子的刺激下，逐渐成熟并迁移到外周免疫器官，丧失摄取抗原的能力，发挥提呈抗原的作用，激活T细胞，启动免疫应答[9-10]。我们用DC刺激同种异体T淋巴细胞，结果显示，LPS持续刺激能明显抑制DC的促增殖功能和抗原提呈功能，与DC受到不同刺激后表面成熟标志的表达变化一致。

成熟的DC还分泌较高水平的细胞因子，如IL-12，IFNγ等[11]。我们通过对第3次换液时的细胞上清液和收细胞时的细胞上清液中细胞因子的测定表明，持续LPS刺激均缺乏增加DC分泌细胞因子的能力，而最后2d加入LPS后，DC分泌细胞因子的水平升高，提示持续LPS刺激抑制了DC产生IFNγ和IL-12的能力。Langenkamp等[12]研究发现，LPS刺激开始时引起DC大量分泌IL-12，但是延长刺激时间后将导致IL-12生成耗竭而引起Th2极化，与我们的实验结果相同。

DC分泌的IL-12可促进Th0细胞向Th1细胞分化,并在T细胞的增殖活化,尤其是在促进CD8+ 细胞毒性Ｔ淋巴细胞的杀伤活性中发挥重要作用[13]。值得一提的是，IL-12和IL-18对Th1→IFNγ有协同作用，可能是因为激活信号的传递是以乘法规则进行的[5]。IFNγ对Th1的促进是间接的，对Th2的抑制是直接的[14]。IL-4，IL-10既抑制IL-12的产生，又抑制其作用的发挥[13]。但是有研究结果表明，在DC未成熟或DC受刺激时加入IL-4，可显著提高IL-12产生的量[15]。

由此可见，持续LPS刺激抑制了DC分泌IL-12和IFNγ，即抑制了Th1分化而间接促进了Th2分化，与我们临床观察的结果相符[1]。已有的研究证实，DC生成IL-12缺陷是T细胞产生Th2应答的重要原因，而Th2亚型占优势与HBV的持续感染有关，所以，DC功能损害是造成免疫反应低下、HBV持续感染的重要原因之一[16]。可以理解为慢性肝病时IETM→DC成熟受抑制→免疫反应低下→病毒难以清除。

本研究从形态、表型和功能方面论证了LPS持续刺激对DC成熟的抑制作用，阐明了IETM引起肝炎患者细胞免疫功能低下的机制。如果我们实验条件确实模拟了内毒素血症患者体内的情况，那么这类患者的DC也处于不成熟状态，因而无法有效活化T细胞，启动免疫应答。

参  考  文  献

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（收稿日期：2009-10-21）

（本文编辑：孙宇航）

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