重组人p53腺病毒基因经介入途径治疗兔VX2肝癌的研究

【摘要】  目的  观察重组人p53腺病毒基因（rAd-p53）经介入途径治疗兔VX2肝癌的效果。方法  将30只新西兰大白兔采用移植法建立兔VX2肝癌模型，并随机均分为A、B、C、D、E 5组，于第11天分别行磁共振成像、CT检查，计算肿瘤体积后对各组模型处理，A组：经肝动脉灌注等渗盐水0.5ml/只；B组：经肝动脉灌注超液态碘油0.5ml/只；C组：经肝动脉灌注rAd-p53 1×106/VP；D组：经肝动脉灌注rAd-p53 1×106/VP加超液态碘油0.5ml/只；E组：肿瘤内直接注射rAd-p53  1×106/VP。14d后再行磁共振成像、CT检查，计算肿瘤体积。处死实验兔，免疫组织化学方法检测肿瘤细胞凋亡、血管内皮生长因子及Ⅷ因子表达情况，对Ⅷ因子阳性血管内皮细胞进行微血管密度计数，并结合其病理学特征进行分析。多组间的比较用方差分析，多组数据两两比较用Student-Newwman-Keuls法检验，两组间比较用成组t检验，对方差不齐者用秩和检验。 结果  分组处理前，A、B、C、D、E组肿瘤体积分别为（79.4±8.2）、（75.3±7.8）、（74.6±6.6）、（78.7±9.1）、（75.8±8.4）mm3，各组比较，F＝12.248,P＝0.0636，差异无统计学意义。处理后5组肿瘤体积分别为（564.7±96.7）、（176.5±83.2）、（239.6±42.8）、（159.8±58.6）、（334.7±32.6）mm3，各组比较，F＝24.537，P＝0.0218，差异有统计学意义。处理前后肿瘤增长倍数分别为6.9、2.6、3.1、1.6倍和4.1倍。5组凋亡率分别为12.0%±1.1%、14.5%±2.1%、17.6%±2.3%、18.6%±2.3%和19.6%±2.5%，各组比较，F＝6.23，P＝0.024，差异有统计学意义。血管内皮生长因子表达阳性率分别为50.0%、83.3%、83.3%、50.0%和50.0%，各组比较，F＝7.84，P＝0.019，差异有统计学意义。5组吸光度值分别为81.6±16.1、85.2±24.3、75.2±23.9、71.1±21.3和72.3±25.2，各组比较，F＝0.854，P＝0.018，差异有统计学意义。 结论  rAd-p53对兔VX2肝癌有较好的治疗效果，以与超液态碘油经肝动脉联合灌注治疗最为有效。

【关键词】  癌，肝细胞； 模型，动物； 基因疗法； 磁共振成像； 放射学，介入性

Experimental studies of rAd-p53 injection by interventional approach for the treatment of rabbit VX2 liver cancer    LUO Shi-hua*, ZHENG Chuan-sheng, FENG Gan-sheng, SUN Xi-mei, ZHOU Guo-feng, LIANG Hui-min, XIA Xiang-wen, FANG Jian-lin. *Department of Radiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China

Corresponding author: ZHENG Chuan-sheng, Email: hqzcsxh@ sina.com

【Abstract】 Objective    To evaluate the efficacy of recombinant human adenovirus p53 gene therapy (rAd-p53) in the rabbit VX2 liver cancer model using different interventional therapy approach. Methods   Thirty New Zealand rabbits implanted with VX2 tumor in the liver were randomized into five groups with six of each. The tumor volumes (V1) were measured by MRI and CT scan 11 days after tumors implanted. The interventional therapy scheme performed as below: intraarterial 0.9% saline solution perfusion in group A, transcatheter arterial embolization with 0.5ml ultrafluid lipoidol in group B, intraarterial rAd-p53 gene perfusion in group C (1×106/VP); intraarterial rAd-p53 gene perfusion (1×106/VP) in combination with transcatherter arterial embolization (ultrofluid lipiodol, 0.5 ml) in group D and intratumoral rAd-p53 gene (1×106/VP) injection in group E. The tumor volumes (V2) were measured by MRI and CT scan, and the tumor growth ratios were calculated 14 days after interventional procedures. Then all animals were sacrificed. The tumor tissues were explanted for immunohistochemistry to observe the expressions of vascular endothelial cell growth factor (VEGF) and factor VIII. Microvessel density (MVD) of the tumor tissues was assessed by factor VIII immunohistochemical analysis. In addition, apoptotic index was assessed by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) staining. Results    The tumor volumes before therapy were (79.4±8.2), (75.3±7.8), (74.6±6.6), (78.7±9.1), (75.8±8.4) mm3 respectively, without differences found among them (F = 12.248, P = 0.0636). But the tumor volumes after therapy were (564.7±96.7), (176.5±83.2), (239.6±42.8), (159.8±58.6), (334.7±32.6) mm3 respectively (F = 24.537, P = 0.0218). The tumor growth ratios were 6.9, 2.6, 3.1, 1.6 and 4.1 respectively. The mean apoptosis index were 12.0%±1.1%, 14.5%±2.1%, 17.6%±2.3%, 18.6%±2.3% and 19.6%±2.5% respectively. with significant differences in group E in comparison with the other four groups. Mean positive ratio of VEGF was 50.0%, 83.3%, 83.3%, 50.0% and 50.0% respectively, with significant differences observed in group B and group C compared with the other three groups (F = 7.84, P = 0.019). The differences of VIII factor positive expression ratio among each group were significant (F = 0.854, P = 0.018). Statistical analysis showed a positive correlation between the expression of VEGF and MVD (r = 2.400, P = 0.0233). Conclusion    The rAd-p53 has effective treatment outcomes in VX2 rabbit liver cancer, and intra-arterial rAd-p53 gene perfusion in combination with transcatherater arterial embolization is the best approach in comparison with intra-arterial rAd-p53 gene perfusion, transcatherater arterial embolization and intratumoral rAd-p53 gene injection alone.

【Key words】Carcinoma, hepatocellular; Models, animal; Gene therapy; Magnetic resonance imaging; Radiology,interventional

本研究探讨重组人p53腺病毒基因（rAd-p53）通过介入途径局部靶向给药后与常规介入治疗的协同作用，讨论基因治疗的可行性、疗效，为临床基因治疗提供动物实验依据。

材料与方法

1. 实验材料：rAd-p53注射液（1×1012/VP）由深圳赛百诺基因技术有限公司惠赠；超液态碘油购自法国Guerbet公司；血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、Ⅷ因子抗体及相应第二抗体均购自美国Neomarkers公司，由中国武汉博士德生物工程有限公司分装；兔抗兔细胞凋亡检测试剂盒购自美国Santa Cruz公司，由北京中杉生物技术有限公司分装。

2. 兔VX2肝癌模型的建立：新西兰大白兔30只，雌雄不限，体质量2.0～2.5kg，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供；VX2肿瘤细胞由华中科技大学同济医学院附属协和医院介入放射科传代培养。兔麻醉用速眠新购自沈阳军事医学科学院。参照周承凯等[1]的方法建立兔VX2肝癌模型。

3. 实验动物分组及治疗方案：兔VX2肝癌模型建立后11d分别行MRI、CT检查，测量肿瘤最大直径d1及与之成垂直方向的最小直径d2，利用公式V＝d1× d22/2计算肿瘤体积V1。将30只经影像检测种瘤成功VX2兔按成组设计法随机平均分为5组，A组：经肝动脉灌注等渗盐水0.5ml；B组：经肝动脉灌注超液态碘油0.5ml/只，行栓塞治疗；C组：经肝动脉单纯灌注rAd-p53 1×106/VP；D组：经肝动脉灌注超液态碘油0.5ml/只加rAd-p53  1×106/VP；E组：经开腹后直视下在瘤内及瘤周直接注射rAd-p53 1×106/VP。

4. 介入治疗方法：（1）经肝动脉途径：参照文献[2]方法，在完成影像检查后随即用自制的带有连接管的细针行经肝动脉途径治疗。（2）直接注射途径：荷瘤VX2兔在完成影像学检查后，在直视下用注射器向瘤内、肿瘤边缘及瘤周注射药物。

5. 肿瘤增长率检测：介入术后第14天按上述方法再分别行MRI、CT检查，计算肿瘤体积V2，并计算肿瘤生长率。

6. 病理学检测：介入术后14d完成MRI及CT检查，处死实验兔，取肿瘤及周围0.5cm×0.5cm×0.5cm肝组织，经4%的甲醛固定，石蜡包埋，5μm连续切片,行免疫组织化学染色，用不同抗体分别检测肿瘤细胞凋亡、VEGF、Ⅷ因子表达情况，对Ⅷ因子阳性血管内皮细胞进行微血管密度（MVD）计数，结合其病理学特征进行分析。免疫组织化学染色按试剂盒说明书进行。（1）肿瘤细胞凋亡结果判读：以细胞核棕黄色染色为阳性。每例在400倍视野下于肿瘤区选择3个视野进行定量分析，计数100个细胞，缺口平移末端转移酶标记法染色阳性细胞所占百分比为凋亡指数。（2）VEGF免疫组织化学结果判读：VEGF阳性表达表现为肿瘤细胞胞质内的棕黄色颗粒状染色区，其VEGF半定量判定标准参照Jakovljevic`等[3]的方法。（3）CD31单克隆抗体检测肿瘤的MVD：CD31阳性表达表现为内皮细胞胞质和胞膜的棕黄色颗粒状染色区。由两位病理学医师，采用双盲法进行观察。MVD计数采用Choi等[4]报告的方法。

7. 统计学处理：多组间的比较用方差分析，多组的两两间比较用Student-Newwman-Keuls法检验，两组间比较用成组t检验，对方差不齐者用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. 肿瘤增长率比较结果：分组处理前A、B、C、D、E组肿瘤体积分别为（79.4±8.2）、(75.3±7.8）、(74.6±6.6）、(78.7±9.1）、(75.8±8.4）mm3，各组比较，F＝12.248，P＝0.0636，差异无统计学意义。处理后各组肿瘤体积分别为（564.7±96.7）、（176.5±83.2）、（239.6±42.8）、（159.8±58.6）、（334.7±32.6）mm3，各组比较，F＝24.537，P＝0.0218，差异有统计学意义。处理前后比较，各组肿瘤增长倍数分别为6.9、2.6、3.1、1.6倍和4.1倍。

2. 免疫组织化学检测结果：（1）肿瘤细胞凋亡：在瘤内坏死区域周围，染色阳性细胞较多，呈弥散或灶状分布，在瘤内其他部位则较少，呈散在分布。在瘤周，特别是包膜受浸润区域，凋亡阳性细胞较瘤内丰富，见图1。各组间凋亡率分别为12.0%±1.1%、14.5%±2.1%、17.6%±2.3%、18.6%±2.3%和19.6%±2.5%，各组比较，F＝6.23，P＝0.024，差异有统计学意义。（2）VEGF的表达：表达为弥漫性或焦距表达于几个癌巢中，靠近肿瘤边缘区域及坏死组织中的癌巢表达较显著，连续切片显示阳性癌巢周围微血管较多，正常肝组织中未见表达，见图2。VEGF表达，A组阳性3例（++ 1例，+ 2例），B组阳性5例（+++ 2例，++ 2例，+ 1例），C组阳性4例（+++ 1例，++ 2例，+ 1例），D组阳性3例（++ 2例，+ 1例），E组阳性3例（+++ 1例，++ 1例，+ 1例），阳性率分别为50.0%、83.3%、83.3%、50.0%和50.0%，各组比较，F＝7.84，P＝0.019，差异有统计学意义。（3）Ⅷ因子的表现：Ⅷ因子在肿瘤瘤巢中，表现为血管内皮细胞胞质棕黄至棕褐色，呈窦隙样不均匀分布，在正常肝窦处未见阳性表达，而较远处阳性表达相对较低，见图3。A、B、C、D、E5组吸光度值分别为81.6±16.1、85.2±24.3、75.2±23.9、71.1±21.3和72.3±25.2，各组比较，F＝0.854，P＝0.018，差异有统计学意义。 

讨    论

p53作为抑癌基因，主要参与细胞周期的调控，作为反式作用因子或转录因子调节基因的表达，同时还参与细胞间的信号传递，并和细胞生长及迁移有关[5]。肿瘤细胞的生长系通过肿瘤细胞增殖与凋亡间的平衡进行调节，肿瘤细胞凋亡减少或增殖活性增加均可导致肿瘤进展。介入治疗前5组肿瘤体积比较，差异无统计学意义，而术后5组肿瘤体积的差异有统计学意义，以D组最低，表明rAd-p53联合超液态碘油经肝动脉灌注通过各种机制对VX2肝癌治疗效果最好。各组肝癌细胞核内凋亡小体形成，以C、D、E组凋亡率较明显，且E组最高，表明经介入方式在肝癌细胞内导入rAd-p53后肝癌细胞凋亡率增加。在细胞凋亡调控机制方面，研究结果显示p53基因导入肝癌细胞后除A、B组外，随着时间的变化，肝癌细胞的凋亡率也随p53的表达同步变化。

本研究结果显示，VEGF的表达为弥漫性或焦距表达于几个癌巢中，靠近肿瘤边缘区域及坏死组织中的癌巢表达较显著，B、C组阳性率较A、D、E组高，Ⅷ因子表达以B组最高。 VEGF是目前已知作用最强的促血管生成生长因子之一，为肿瘤的浸润和转移创造条件[6-7]。MVD是目前用以检测肿瘤新生血管生成程度的常用指标，它在一定程度上反映了特别是肿瘤的浸润、复发及转移的能力，并可作为判断其血供情况，在一定程度上间接预测残存肿瘤细胞的生物学活性[8-9]。本研究结果显示rAd-p53可以单独或与超液态碘油混合使用从而起到抑制肝癌细胞经肝动脉化学治疗栓塞术后新生血管的作用。

经介入途径在瘤内及肝动脉内给药有很好的耐受性，可减少机体与载体的接触面积，减少机体的免疫反应和载体的不良反应[10]。本研究中3种不同的介入导入方式均能安全有效地促进肿瘤细胞凋亡，表明经介入途径行基因靶向治疗是一种更为有效的导入方式；肿块内行一次多点注射、多次注射与常规肝动脉栓塞治疗相结合可以更好地提高疗效。对于大的、药物不能充分到达整个肿块而影响疗效的肝癌，直接注射方式与常规碘油混合灌注有较强的互补作用，可提高效果。上述3种介入基因导入方式中基因表达以瘤内直接注射方式最高，治疗效果以与碘油混合行肝动脉栓塞治疗最高，其原因可能为肿瘤抑癌基因有多种，p53基因只是其中一种[11]或肿瘤的浸润、复发和转移机制复杂，经肝动脉化学治疗栓塞术能通过多种途径抑制其浸润、复发和转移等。本研究中rAd-p53通过抑制肿瘤细胞VEGF表达及MVD生成发挥抑制作用，其二者可能存在协同关系；rAd-p53与碘油混合肝动脉灌注能较均匀分布于肿瘤组织内。

志谢  深圳赛百诺基因工程有限公司惠赠重组人p53腺病毒基因注射液及华中科技大学同济医学院病理学系赵毅教授对病理检测的指导工作

参  考  文  献

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(收稿日期：2009-10-10)

（本文编辑：孙宇航）

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