【关键词】 肝硬化； 免疫； 肝星状细胞； Toll样受体 The immunological mechanisms of liver fibrosis 【Key words】Liver cirrhosis; Immunology; Hepatic stellate cell; Toll like receptors 【First author’s address】Division of Digestive Diseases, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China Corresponding author: GUO Jin-sheng, Email: guo.jinsheng@ zs-hospital.sh.cn 肝脏是人体最大的消化器官，虽然不属于免疫系统，但由于其特殊的解剖位置和血管系统，使肝脏在免疫细胞的激活和分化、机体的局部和全身性免疫反应、以及免疫调节等方面具有重要作用。免疫应答导致的肝损伤是许多肝脏疾病的发病机制，同时也参与各种病因引起的肝纤维化发生。 一、肝脏的解剖、细胞组成和肝纤维化（肝硬化）的病理改变 肝脏有一套动脉系统、两套静脉系统（其中门静脉来自内脏器官，肝静脉来自门静脉之间的动脉网）和丰富的血窦网络。从胃肠道来源的抗原随门静脉血液在肝血窦与丰富的抗原提呈细胞（antigen presenting cells, APC）及淋巴细胞接触；单层的血窦内皮及窗孔结构便于淋巴细胞渗出到Disse间隙并接触细胞外基质（ECM）、肝星状细胞（HSC）和肝细胞，这些特点均有利于刺激淋巴细胞活化和激活免疫反应。 正常时肝细胞占总肝实质细胞的三分之二，其余为非实质细胞。其中，淋巴细胞数目最多，约1010，包括经典的淋巴细胞亚群（即具有α、β链的CD4+和CD8+T淋巴细胞）和具有细胞溶解活性的自然杀伤（natrural killer, NK）细胞等。NK细胞在肝脏占肝内淋巴细胞的30%，比其他器官更为丰富。其余非实质细胞如枯否细胞（kupffer cells, KC）、血窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells, LSEC）、树突状细胞（DC）均为肝脏驻留APC，在非炎症状态下对维持免疫耐受起到重要作用。肝细胞虽然也具有抗原呈递功能，但通常被认为是细胞免疫的靶细胞。 纤维化发生过程中肝脏内各种细胞的比例和数目发生显著改变。主要病理特点是肝细胞损害、炎症细胞募集、肝肌成纤维细胞激活和增生，ECM增多和积聚，包绕损伤和再生的肝细胞形成不完整到完整的纤维间隔和假小叶。反复的损伤－炎症－纤维化发生过程和积累最终导致肝硬化的形成，肝脏小叶结构被异常的硬化结节所取代，血管重构，实质细胞显著减少并出现肝功能衰竭。 二、肝脏免疫反应特点 1. 肝脏固有免疫：肝脏是以固有免疫为主导的免疫器官[1]。分布有丰富的固有免疫效应细胞（单核/吞噬细胞、NK细胞、DC、肥大细胞及NKT淋巴细胞），以抗原非特异性方式识别并清除抗原物质。这些固有免疫细胞可通过模式识别受体（pattern-recognition receptors, PRR）直接识别和结合病原体病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMP）而被激活，启动机体免疫防御反应。PAMP主要包括：（1）糖类和脂类为主的细菌胞壁成分，如脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）。（2）病毒产物及细菌胞核成分，如非甲基化寡核苷酸CpG DNA、单链及双链RNA等。PAMP由可溶性的模式识别分子（如脂多糖结合蛋白）及定位于固有免疫细胞的PRR所识别。PRR包括Toll样受体（toll like receptors, TLRs）和核苷酸结合寡聚化结构域样受体等。其中对TLR4的研究最为深入和详细。 2. 肝脏适应性免疫：肝脏细胞免疫有以下特点：（1）CD4+ T淋巴细胞的发育和存活偏向Th2表型。（2）CD8+ T淋巴细胞激活分化成CD8+细胞毒性T淋巴细胞，能杀伤任何在胞质内含有外源微生物的有核细胞。肝脏体液免疫的特点是：B淋巴细胞可能通过非抗体依赖的方式在肝纤维化中起作用，如通过分泌细胞因子（Th1样或Th2样细胞因子分泌模式）或与其他细胞的直接相互作用而形成促纤维化的微环境，加强局部细胞反应并促进转化生长因子β1（TGFβ1）的分泌[2]；以及提供给T淋巴细胞、NKT淋巴细胞和KC的协同刺激信号等。慢性肝病的反复组织损伤可维持B淋巴细胞激活，甚至使这一过程自身永久激活。 三、肝脏炎症反应与肝纤维化发生 炎症是启动和促进肝纤维化进展的重要因素，慢性炎症和纤维化发生是一个积聚淋巴细胞、巨噬细胞、基质细胞分泌和旁分泌相互作用的动态过程[3]。基质微环境、基质与浸润淋巴细胞的相互作用决定慢性肝脏炎症性疾病的纤维化发生。固有免疫与适应性免疫均参与肝损伤和纤维化发生，它们在病原清除、细胞杀伤（如在抗病毒免疫反应中的肝细胞损伤）、炎症调节、肌成纤维细胞激活、肝纤维化调节的自发消退中具有许多“好”或“坏”的功能。另一方面，损伤的肝细胞、KC和HSC参与炎症诱导；基质细胞能调节APC的分化和功能；基质中细胞因子和趋化因子的分泌模式可决定T淋巴细胞的迁移和极化[2]。 四、肝脏非实质细胞在肝纤维化发生过程中的作用及相互关系 1. HSC：它在肝脏免疫调节、免疫抑制和炎症反应中起到重要调节作用。HSC相关的免疫应答可被看作为肝纤维化发生中所有免疫应答的核心部分。（1）HSC是肝脏炎症反应的靶细胞：HSC的激活是肝纤维化发生的中心环节，持续激活后有以下特点：增殖、迁移和表型转化，成为肌成纤维样细胞而合成和分泌间质胶原等各种ECM，自分泌产生致纤维化细胞因子（如TGFβ1）；释放胶原酶抑制物组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）1，通过抑制胶原酶活性、减少基质的降解而促进纤维化的发展[4]；分泌趋化因子及其他炎症性细胞因子；具有细胞收缩特性，成为肝窦狭窄、门静脉压升高的重要因素；合成基质金属蛋白酶（MMP），使ECM降解异常，既直接加重肝纤维化程度，又可以通过整合蛋白信号通路刺激HSC生长，旁分泌及自分泌细胞因子，形成正反馈通路。（2）HSC是肝脏炎症反应的效应细胞：HSC具有完整的炎症信号途径：激活的HSC表达模式识别受体TLR4和TLR9等，并在它们的配体刺激下激活其下游传导途径（NF-κB和JNK信号等）和转录因子，诱导一系列具有募集和激活巨噬细胞的趋化因子、炎症性细胞因子和黏附分子等，促进炎症细胞浸润和扩大炎症反应[5-7]。TLR4信号途径的激活还可通过下调TGFβ1假受体BAMBI，使TGFβ1信号通路敏感化而促进纤维化发生[6]。（3）HSC具有抗原呈递功能：HSC能刺激淋巴细胞增生，可对内、外源性蛋白和脂质抗原产生特异性T淋巴细胞反应，表达主要组织相容性抗原复合物（MHC）Ⅰ类分子CD1及MHCⅡ类分子，分别向NKT和CD4+ T淋巴细胞提呈抗原，介导肝内的细胞免疫[8]；因此，有人认为HSC是肝脏内的一种职业性APC。（4）HSC可能主导肝脏的免疫耐受：近年研究结果表明HSC具有免疫抑制功能，表现为诱导T淋巴细胞凋亡和促进调节性T淋巴细胞的产生等。HSC是肝脏分泌TGFβ1的主要细胞，它可诱导原始CD4+ T淋巴细胞向调节性T淋巴细胞分化，将细胞免疫向免疫耐受诱导。活化的HSC表达协同刺激因子B7家族的抑制性分子B7-H1[9]；B7-H1的受体是程序性死亡-1，可在CD4+ T淋巴细胞等免疫细胞表达，极低水平的活化就足以抑制早期阶段的T淋巴细胞激活，并可抑制细胞抗凋亡基因Bcl-xL的表达以及Akt的活化，促进T淋巴细胞凋亡。 2. KC：KC是肝脏特异的巨噬细胞群体，是肝脏炎症反应的重要效应细胞。KC与HSC的相互作用是肝纤维化发生的核心事件。KC可借助PRR非特异性识别和清除抗原分子，通过激活NF-κB等转录因子调节一系列炎症性细胞因子、趋化因子和其他炎症介质，以及促纤维化细胞因子的表达，参与肝损伤、炎症和纤维化发生。 3. 淋巴细胞：（1）T淋巴细胞：CD4+ T淋巴细胞可调节局部细胞因子反应，通过直接作用于基质巨噬细胞和成纤维细胞促进纤维化发生；而CD8+ T淋巴细胞可通过增加组织损伤而促进纤维化。HSC可由特殊的T淋巴细胞亚群激活，其中CD8+ T淋巴细胞比CD4+ T淋巴细胞具有更强的促纤维化发生活性。（2）NK细胞：NK细胞可被干扰素（IFN）α、IFNγ或双链RNA激活，通过直接杀伤HSC和产生IFNγ负向调节纤维化[10]。NK细胞在固有免疫中的效应受体是自然细胞毒受体、NKG2D和一些辅助受体。NK细胞对HSC的作用依赖于NKG2D，只有早期激活的HSC才表达NKG2D的配体以及肿瘤坏死因子（TNF）相关诱导凋亡配体（TRAIL）的受体，因此，NK细胞只杀死早期激活的HSC[11]。（3）NKT淋巴细胞：是一种具有T淋巴细胞受体的NK细胞。NKT淋巴细胞可以识别由CD1d（在硬化肝脏内由APC大量表达）呈递的内源性脂质配体，通过分泌白细胞介素（IL）-4、IL-13来促进纤维化[12]。 五、细胞因子与肝纤维化 细胞因子是HSC与其他细胞进行信息交换的重要介质，在HSC的活化、增殖及凋亡中发挥重要作用。细胞因子可分为生长因子、IL、炎症性细胞因子和趋化因子以及IFN等几类，其中对肝纤维化有促进作用的细胞因子主要有TGFβ1、血小板衍生生长因子（PDGF)、和IL-1β等。 1. 生长因子：（1）TGFβ1：是已知最强有力的促肝纤维化因子。在肝纤维化发生过程中大多来自HSC的自分泌及KC的旁分泌。TGFβ1作用于HSC后通过胞内信号传递分子Smad蛋白增加ECM合成，同时抑制MMP-1的合成、促进TIMP的合成。TGFβ1还可诱导HSC分泌其他促纤维化的细胞因子，从而起到持续、连锁、逐级放大的纤维化效应。TGFβ1还可以通过抑制死亡受体FasL（CD95L）蛋白的转录、抑制p53基因、上调NF-κB、BCL-xL及p21等蛋白的表达和活性以抑制HSC凋亡，促使其存活。（2）PDGF：是已知作用最为强大的推动HSC细胞周期的细胞因子，主要由巨核细胞、肝脏KC及HSC表达，对肝纤维化的发生起重要作用。PDGF通过激活丝裂原活化激酶信号通路、下调p27表达促进HSC进入S期。 2. IL：IL在肝纤维化过程中作用复杂。概括地说，IL-1β、IL-6有促肝纤维化的作用，IL-10有抑制肝纤维化的作用，其他IL的作用尚不明确。（1）IL-1β: 为炎性反应介质和促纤维化细胞因子，在肝脏中主要由KC合成，可促进HSC活化和转化为肌成纤维细胞、促进HSC增殖、促进TIMP合成和抑制MMP对ECM的降解。此外IL-1β还可以通过细胞因子网络式反应提高IL-6、TGFβ1及TNFα的表达。（2）IL-6: 是一种具有多重免疫调节功能的细胞因子，T淋巴细胞、单核-巨噬细胞、成纤维细胞均可合成，促进肝脏炎症反应和ECM沉积，促进其他炎症性细胞因子的表达。活化的HSC有分泌IL-6的功能并受IL-6调节。IL-6对HSC的作用包括：促进HSC增殖和胶原形成，促进TIMP合成，抑制MMP合成。（3）IL-10：是一种Th2类细胞因子，类似IFNγ介导的免疫抑制效果。IL-10可负调节KC功能，能抑制KC分泌TNFα、IL-6、IL-1，并因此下调HSC的活化。IL-10可由激活的HSC产生并在体外表现出抑制其纤维化发生作用。IL-10基因敲除鼠比野生型鼠出现更显著的纤维化和更高的TNFα水平。然而类似于IFNγ，IL-10临床试验结果显示，尽管IL-10能在部分丙型肝炎患者体内减轻炎症和纤维化积分，但也会因减弱对病毒的免疫监视作用而增加病毒负荷[13]。 3. 炎症性细胞因子和趋化因子：（1）TNFα：是固有免疫中最重要的细胞因子，在肝脏中主要由活化的KC分泌。TNFα是由病毒、乙醇、毒素、内毒素等肝损伤因素诱导，在激发其他细胞因子并共同募集炎症细胞、杀伤肝细胞、启动肝再生和纤维化发生的反应中起重要作用。在非酒精性脂肪性肝炎中，TNFα促进胰岛素抵抗的形成[14]。TNFα对活化HSC的作用是导致MMP-1、MMP-9合成增加，促炎症细胞因子和黏附分子产生增加，细胞凋亡被抑制[15]。（2）单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）：是一种调节白细胞、单核-巨噬细胞和淋巴细胞募集和浸润的趋化因子，通过与其特异性受体CCR2结合发挥作用。抑制MCP-1可显著抑制肝纤维化的发生。 4. IFN：IFNγ是一种Th1型免疫调节细胞因子，可直接作用于HSC，抑制胶原等ECM组分的基因表达，抑制HSC细胞增殖，促进其凋亡。IFNγ还可通过促进NK细胞活性以清除HSC。IFNγ通过调节STAT-1磷酸化、上调Smad7表达和抑制TGFβ信号发挥抗纤维化作用[16]。 六、PRR与肝纤维化发生 TLRs是哺乳动物跨膜PRR，能识别细菌、真菌和病毒独特的结构成分，传导信号并激活固有和适应性免疫反应。目前在人类发现的TLRs有10种，具有各自或共有的激活底物。TLRs信号由NF-κB、丝裂原激活蛋白激酶、PI3K-AKT途径激活，下游产物包括：炎症前细胞因子（TNFα、IL-1、IL-6）；趋化因子（MCP-1、MIP-2、MIF）；炎症相关蛋白（iNOS）；活性氧；黏附分子（ICAM-1, VCAM-1）；以及其他固有免疫反应效应因子如IFNβ。 1. TLR4：肝脏内TLR4可在大多数驻留细胞包括KC、HSC和肝细胞表达, TLR4信号参与多种病因引起的肝脏炎症和损伤。TLR4遗传缺失或变异动物在实验性肝损伤模型肝脏内巨噬细胞浸润减少，损伤程度较轻。除了天然外源性底物LPS外，内源性底物如透明质酸片段、自由脂肪酸、血清纤维蛋白原、纤维结合素、热休克蛋白60和70、高迁移率族蛋白B1等也能结合和激活TLR4；体内损伤信号和降解的细胞外基质可激活TLR4[17]。这些内源性配体在肝纤维化发生中的作用有待深入研究。最近研究结果提示，HSC的TLR4信号在介导纤维化发生中可能起到更重要的作用，因其可以下调抑制性TGFβ1假受体BAMBI[6，18]。 2. TLR2：当HSC接触LPS或TNFα时，其表面的TLR2表达明显上调。TLR2可识别HCV的核心蛋白及NS3蛋白，产生炎症性细胞因子，可能影响机体对HCV的识别和固有免疫反应[19]。 3． TLR3：近年来TLR3也被发现在纤维化过程中发挥作用。NK细胞内TLR3被聚肌苷酸胞苷酸激活后，通过旁分泌及自分泌IFNγ发挥效应，对肝纤维化起到负调节作用[11]。目前还没有发现TLR3的天然配体，双链RNA可启动类似反应。 4.TLR9：TLR9是胞内表达的PRR，它的配体是非甲基化CpG DNA。在哺乳动物体内，HSC有两种情况可以接触到这种DNA片段：其一是凋亡肝细胞的DNA片段，其二是门静脉带来的原核生物DNA[7]。HSC可通过TLR9被肝细胞凋亡产生的DNA片段激活[20]。 参 考 文 献 [1]Gao B, [2]Holt AP, Salmon M, Buckley CD, et al. Immune interactions in hepatic fibrosis.Clin Liver Dis, 2008, 12: 861-882, x. [3] [4]Friedman SL. Hepatic fibrosis -- overview.Toxicology, 2008, 254: 120-129. [5]Paik YH, Lee KS, Lee HJ, et al. Hepatic stellate cells primed with cytokines upregulate inflammation in response to peptidoglycan or lipoteichoic acid. Lab Invest, 2006, 86: 676-686. [6]Seki E, De Minicis S, Osterreicher CH, et al. TLR4 enhances TGF-beta signaling and hepatic fibrosis. Nat Med, 2007, 13: 1324-1332. [7]G鋌ele E, M黨lbauer M, Dorn C, et al. Role of TLR9 in hepatic stellate cells and experimental liver fibrosis. 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