【摘要】目的 建立I-SceⅠ系统并应用该系统制备DNA双链断裂（DSB）的HepG2细胞模型，为进一步研究DSB与HBV DNA整合奠定基础。 方法 通过分子克隆技术构建携带I-SceⅠ内切酶识别序列的pEGFP2真核表达载体，并将其转染入肝癌细胞株HepG2，经G418筛选出稳定转染株，随后瞬时转染表达归位内切酶I-SceⅠ的质粒pCMV-3NSL-I-SceⅠ。24h后采用免疫荧光法和Western blot检测DNA双链损伤效应分子γ-H2AX的表达，了解DSB情况。 结果 酶切鉴定和测序证实pEGFP2构建成功；I-SceⅠ系统引入后HepG2细胞中的γ-H2AX表达明显上调，提示DSB细胞模型构建成功。 结论 I-SceⅠ系统能够成功地诱导HepG2细胞株基因组发生DSB，该系统有望为进一步探讨DSB是否为HBV整合的潜在靶位提供有效的研究工具。 【关键词】DNA损伤； 癌，肝细胞； 内切核酸酶类； I-SceⅠ系统； γ-H2AX分析法 Establishment of an I-SceI system and its application to introduce DNA double-strand break into human hepatoma cell line HepG2 REN Jing-hua*, HE Wen-shan, LIN Ju-sheng, ZHANG Qiang, HE Xing-xing, CHEN Qiong, LIU Yao, XU Dong. *Institute of Liver Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China Corresponding author: LIN Ju-sheng, Email: jslin@ tjh.tjmu.edu.cn 【Abstract】Objective To construct a system of I-SceI and induce a site-specific DNA double-strand break (DSB) in the genome of HepG2 for using this system in future exploration of the potential mechanisms of HBV integration by DSB repair. Methods The eukaryotic expression plasmid pEGFP2 was constructed and transfected into human hepatoma cell line HepG2. The positive neomycin-resistant transfected cell clones were generated by G418 selection. Then the positive cells containing an 18-bp I-SceI endonuclease site were transfected transiently with pCMV(3×NLS) I-SceI, an I-SceI expression plasmid. At 24 h post-transfection with pCMV (3×NLS) I-SceI, γ-H2AX, as an early cellular marker of DSB, was detected using immunocytochemistry and Western blot analysis. Results Restriction analysis and DNA sequencing verified that the plasmid pEGFP2 was successfully constructed. γ-H2AX increased significantly in cells transfected with the I-SceI system. Conclusions Genomic DSB can be induced into HepG2 by introducing an I-SceI system. The cell model could provide us with a practical tool for further study to see if DSB is a potential target for HBV integration. 【Key words】DNA damage; Carcinoma, hepatocellular; Endonucleases; I-SceI system; γ-H2AX assay HBV的整合不是病毒复制所必须的，但乙型肝炎相关性肝癌组织标本中HBV DNA整合的检出率高达80％[1]。大量研究显示，HBV DNA整合后会引起插入突变、DNA缺失、染色体重排甚至基因组的不稳定。此外，整合型HBV DNA导致原癌基因的激活及抑癌基因的失活也备受关注。关于HBV DNA整合的研究必将在分子水平上为HBV致癌作用提供进一步的证据，但到目前为止，HBV DNA整合的分子机制仍不清楚。DNA损伤，尤其是DNA双链断裂（DNA double-strand breaks，DSB）可促进嗜肝病毒DNA整合入宿主基因组[2]，这种整合的过程可能是借助机体修复DSB的机制完成的[3]。DSB是DNA损伤中最为严重的一种类型[4]，引起DSB的原因包括内源性的代谢产物[5]，外源性的理化因素如电离辐射及生物因素如逆转录病毒整合入宿主基因组等[6，7]。针对这种损伤形式，机体可通过同源重组（homologous recombination，HR）和非同源末端连接（non-homologous end-joinling，NHEJ）两种方式对其进行修复[8]。目前，国内对于DSB的研究多集中于电离辐射（如γ射线和不同传能线密度的重离子）诱导的细胞基因组DNA损伤及其检测，但是电离辐射所致的DSB位点随机且不是单一的，多为碱基损伤、单链或双链断裂和DNA交联的复合，即所谓“簇损伤（clustered damage）”。这给我们研究DSB及其修复与HBV DNA整合的研究带来许多不确定因素。本研究拟建立I-SceⅠ系统并应用该系统制备位点特异性肝癌细胞模型，为进一步研究HBV DNA整合的分子机制打下基础。 材料与方法 1．主要材料：表达归位内切酶I-SceⅠ的真核表达载体pCMV-3NSL-I-SceⅠ由美国新墨西哥医学院Nickoloff教授惠赠，真核表达载体pEGFP-C1由华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所保存，肝癌细胞株HepG2购自中国典型培养物保藏中心，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，兔抗人γ-H2AX（S139）抗体购自美国R&D公司，辣根过氧化物酶标记的第二抗体购自北京中山公司，FITC标记羊抗兔IgG第二抗体和兔抗人actin抗体购自美国Santa Cruz公司，电化学发光试剂购自美国Pierce公司。 2. pEGFP2真核表达载体的构建及鉴定：Sce-GFP由片段A和B组成，首尾截断型EGFP（iGFP）由片段C组成，合成这3个片段的模版均为pEGFP-C1质粒。具体操作过程如下：采用小量质粒抽提试剂盒提取pEGFP-C1，紫外分光光度计定量后将其工作浓度调至1mg/L。使用日本TaKaRa公司生产的高保真DNA聚合酶Pyrobest扩增目的片段，PCR引物序列如下，划线部分示酶切位点：片段A上游引物5′-CTAGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCA T-3′（NheⅠ），下游引物5′-ATTACCCTGTTA TCCCTAGCCGGACACGC-3′（I-SceⅠ），产物长140bp，循环退火温度59℃；片段B上游引物5′-T AGGGATAACAGGGTAATACCTACGGCAA-3′（I-SceⅠ），下游引物5′-GGAAGATCTTTATCCG GACTTGTACAGCTC-3′（BglⅡ），产物长650bp，循环退火温度57℃；片段C上游引物5′-CCGGAAT TCACAAGTTCAGCGTGTCCG-3′（BglⅡ），下游引物5′-CGCGGATCCTTCACCTTGATGCCGTT C-3′（BamHⅠ），产物长417bp。反应条件：95℃预变性10min；95℃ 45s，58℃ 40s，72℃ 45s，共30个循环；72℃ 7min。pEGFP2构建如图1所示。将PCR扩增所得A、B、C 3个片段行浓度20g/L琼脂糖凝胶电泳，胶回收。I-SceⅠ酶切回收片段A和B后形成黏性末端，再经体外连接反应就得到了含有归位内切酶I-SceⅠ识别序列的A＋B片段，即Sce-GFP，Sce-GFP随后被插入到pEGFP-C1的NheⅠ和BglⅡ两酶切位点之间，并将该中间质粒命名为pSce-GFP。中间质粒pSce-GFP和片段C分别经过EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后，将扩增所得的片段C（iGFP）插入到pSce-GFP中去，构建所得的质粒即为pEGFP2。采用KpnⅠ单酶切和NheⅠ/BamHⅠ双酶切的方法对重组质粒pEGFP2进行酶切鉴定，并送往上海生工生物工程公司测序进一步鉴定。 3. 细胞培养与转染：肝癌细胞株HepG2用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37℃，体积分数5%的CO2培养箱中培养，细胞常规消化传代。转染前1d，将处于对数生长期的HepG2细胞按2×104个/孔接种在六孔培养板中。待细胞融合度约为60%～70%时，使用LipofectamineTM 2000将构建成功的pEGFP2真核表达质粒转染入细胞中，每孔pEGFP2（g）: transfectionTM 2000（L）约为6∶8。转染后4h换上新鲜的完全培养基继续培养48h，G418筛选稳定转染株。将筛选所得的肝细胞株接种到六孔培养板中，瞬时转染pCMV-3NSL-I-SceⅠ真核表达载体，转染后24h收集细胞标本用于检测DSB情况。 4．DSB肝细胞模型的鉴定：采用γ-H2AX分析法检测细胞DSB发生情况。免疫荧光：磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞爬片3次，4%多聚甲醛固定细胞10min，PBS洗涤1次，然后用体积分数0.1% Triton X-100渗透10min，PBS洗涤，1% BSA在常温下封闭1h，甩去多余封闭液。兔抗人γ-H2AX（S139）抗体（1∶3000稀释）4℃孵育过夜，PBS洗涤，FITC标记第二抗体（1∶200稀释）在避光条件下室温孵育2h，PBS洗涤3次，碘化丙啶复染30min，缓冲甘油封片，激光扫描共聚焦显微镜观察荧光。Western blot：用含PMSF的裂解液提取细胞总蛋白，未引入I-SceⅠ系统的HepG2细胞作为对照组。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，计算并量取含50μg蛋白质的溶液，经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2h。洗膜后加入兔抗人γ-H2AX（S139）抗体（1∶1000稀释）4℃过夜，TBST洗涤3次，每次10min，加入相应的辣根过氧化物酶标记的第二抗体（1∶2000稀释），37℃杂交1h。电化学发光试剂A、B液等体积加到硝酸纤维素膜上，曝光、显影、定影。 5. HR途径修复DSB的检测：DSB发生后，细胞启动HR或NHEJ对DSB进行修复，增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的表达可反映HR修复DSB的情况，其原理见图2。细胞株瞬时转染pCMV-3NSL-I-SceⅠ后36h，在荧光显微镜下观察EGFP表达情况。 结 果 1．A、B、C片段的制备：经过PCR扩增所得的3个片段行20g/L琼脂糖凝胶电泳，在近140bp、650bp和400bp处分别可见一清晰条带（图3）。 2．重组质粒的鉴定：重组质粒pEGFP2由于丢失KpnⅠ单克隆位点未被切成线型；经NheⅠ和BamHⅠ双酶切后产生两个长度分别约为3.9kb和1.1kb的片段，结果与预期一致；而空质粒pEGFP-C1经KpnⅠ单酶切后线型化，经NheⅠ和BamHⅠ双酶切后产生的片段长度则为分别3.9kb和0.8kb（图4）。由此可见，片段A、B、C已插入重组质粒中。重组质粒中的Sce-GFP和iGFP的测序结果进一步证实克隆基因片段插入序列正确，插入接头处的核苷酸序列正常。 3．I-SceⅠ诱导的DSB：使用碘化丙啶和FITC双标技术检测γ-H2AX的表达及亚细胞定位，碘化丙啶用于标记细胞核，激光共聚焦扫描显微镜下显现为红色信号；FITC标记的第二抗体与γ-H2AX抗体特异性结合，激光共聚焦扫描显微镜下显现为绿色信号，红绿两种荧光叠加显示为橙黄色。γ-H2AX定位于HepG2细胞的胞核，空白对照组（即未引入I-SceⅠ系统）中γ-H2AX表达不明显，I-SceⅠ系统引入HepG2细胞后，即在瞬时转染pCMV-3NSL-I-SceⅠ 24h后，γ-H2AX表达明显增加，图中显示为橙色信号显著加强，提示DSB模型构建成功（图5）。Western blot检测γ-H2AX表达结果显示，对照组细胞中γ-H2AX表达甚微，而转染组细胞的γ-H2AX显著增高（图6）。 4. EGFP的表达：在瞬时转染pCMV-3NSL-I-SceⅠ 36h后，HepG2细胞株中可见EGFP表达（图7），表明这些细胞中的DSB是通过HR途径修复的。 讨 论 I-SceⅠ是由啤酒酵母菌内含子编码表达的一种归位内切酶，所识别的序列为5′-TAGGGATAACA GGGTAAT-3′，我们参照文献[9]，通过PCR引物设计将I-SceⅠ酶切位点引入到Sce-GFP序列中，带有该酶切位点的质粒pEGFP2经稳定转染到肝细胞株后，HepG2细胞基因组中就人为地引入了归位内切酶I-SceⅠ的识别序列。随后瞬时转染的质粒pCMV-3NSL-I-SceⅠ通过其核定位信号在肝细胞核特异表达I-SceⅠ，它能特异识别并切割肝细胞基因组中相应的位点，从而导致DSB。由于该DSB两端序列已知，故称之为位点特异性的DSB。pEGFP2和pCMV-3NSL-I-SceⅠ所组成的系统即为“I-SceⅠ系统”。 DSB发生瞬间，组蛋白H2AX羧基端一高度保守的SQE结构域中的丝氨酸残基（Ser-139）迅速被磷酸化并聚集到DSB断端所在处形成焦点，该磷酸化的组蛋白即为γ-H2AX。γ-H2AX能迅速转导DNA损伤信号，募集其他DNA损伤反应蛋白到DSB处，引导DNA损伤的修复，该过程仅需数秒钟到数分钟。γ-H2AX对DSB快速、敏感的反应使其成为DSB的标志之一。γ-H2AX分析法也因此成为DSB早期检测的金标准而被广泛应用[11]。我们检测了I-SceⅠ系统诱导后的肝细胞株中DSB发生情况，结果显示I-SceⅠ系统能够成功地诱导HepG2细胞基因组的DSB。 理论上，I-SceⅠ系统不仅能建立DSB模型，甚至可以检测HR修复DSB大致情况。这是因为I-SceⅠ系统诱导pEGFP2中DR-GFP的I-SceⅠ识别序列处发生DSB，当HR途径对其进行修复时，紧随DR-GFP其后的首尾截断型iGFP由于具有与DNA双链断裂末端高度同源序列，它可以作为模板用于修复Sce-GFP的断端，修复完整的DR-GFP序列拥有全长EGFP编码序列，因此能够表达出EGFP；反之，当DSB是通过NHEJ途径修复时，则不能够表达EGFP。由此可见，在转染效率相近的前提下，观测EGFP的表达可以获得HR修复情况。瞬时转染pCMV-3NSL-SceⅠ后48h，荧光显微镜下可以见到EGFP的表达，本实验的结果证实了以上的理论。 综上所述，我们成功地构建了I-SceⅠ系统中的pEGFP2真核表达载体，并用该系统建立了肝细胞株HepG2的DSB模型，这为我们进一步研究DSB及其修复，以及HBV DNA的整合提供了必要的工具。 参 考 文 献 [1]Ganem D, Prince AM. 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