原发性胆汁性肝硬化患者辅助性T细胞17及白细胞介素17A表达的初步研究

【关键词】  肝硬化，胆汁性； 自身免疫疾病； 白细胞介素类

Peripheral blood Th17 cell and serum IL-17A in primary biliary cirrhosis    CHEN Ying, DENG Ri-hui, ZHOU Dan, SUN Jing, HUANG Yu, ZENG Xing, CHEN Qu-bo.

【Key words】Liver cirrhosis, biliary; Autoimmune diseases; Interleukins

【First author’s address】Department of Immunology, the Second Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510120, China

Corresponding author: CHEN Qu-bo, Email: qubochen326@ 126.com

本研究通过对原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）患者外周血辅助性T淋巴细胞（Th）17/CD4+ T淋巴细胞（简称T细胞）比例和白细胞介素（IL）-17A表达水平的检测，为进一步研究Th17细胞在自身免疫性肝病中的作用提供实验依据。

一、资料与方法

1. 研究对象：2008年7月-2009年10月于广东省中医院和中山大学附属第三医院住院或门诊确诊为PBC的35例患者，女30例，男5例，平均年龄（51.5±14.3）岁，诊断均符合2000年美国肝病学会的指导建议[1]。均未用过糖皮质激素类、熊去氧胆酸或其他免疫抑制/增强剂治疗，为实验组。30例来自广东省中医院体检中心的健康志愿者，女26例，男4例，平均年龄（50.2±14.5）岁，均无肝病史，为对照组。研究对象均排除其他自身免疫性疾病及严重器质性疾病。

2. 主要试剂及仪器：抗人异硫氰酸荧光素标记CD4抗体、抗人藻红蛋白标记IL-17A抗体及抗鼠异硫氰酸荧光素标记免疫球蛋白（Ig）G1抗体、抗鼠藻红蛋白标记IgG1抗体、佛波醇乙酯、离子霉素、破膜剂和固定剂均购自美国Biolegeng公司；蛋白质转运抑制剂莫能霉素购自德国Merck公司；RPMI 1640培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）购自广州莱德尔生物技术公司；葡萄糖-泛影葡胺购自上海华精生物科技公司；人IL-17A酶联免疫吸附试剂盒购自美国eBioscience公司；流式细胞检测仪FCM-500购自美国Beckman Coulter公司； Modular020全自动生物化学分析仪购自瑞士罗氏公司。

3．流式细胞术法检测：实验组和对照组于清晨无菌条件下采集静脉血5ml，加入肝素钠抗凝，PBS等体积稀释后，葡萄糖-泛影葡胺密度梯度离心法获取外周血单个核细胞。PBS洗涤2次，用RPMI 1640调整细胞浓度至2×106/ml，接种于24孔培养板后分别加入佛波醇乙酯20μg/L，离子霉素2μg/L和莫能霉素2μg/L，在37℃、5% CO2细胞培养箱中培养4h。收集细胞并计数，等分为同型对照管和测定管，分别加入10μl抗鼠异硫氰酸荧光素标记IgG1抗体和抗人异硫氰酸荧光素标记CD4抗体，4℃避光孵育30min。PBS洗涤2次，固定液室温固定反应20min，PBS洗涤2次。加入破膜剂有利于细胞因子单克隆抗体进入细胞，离心弃上清液后进行胞内细胞因子染色，于对照管中加入10μl抗鼠藻红蛋白标记IgG1抗体，测定管中加入10μl抗人藻红蛋白标记IL-17A抗体，4℃避光孵育30min。去上清液PBS洗涤2次，500ml PBS重悬细胞后上机检测。

4. 血清IL-17A水平与γ－谷氨酰转肽酶（GGT）、碱性磷酸酶（ALP）浓度的测定：取血清保存于-80℃，测定时应避免反复冻融。双抗体夹心酶联免疫吸附法检测IL-17A，酶标仪读取450nm处吸光度值，灵敏度为4pg/ml，操作严格按照试剂盒说明书进行；GGT、ALP浓度经罗氏Modular020型全自动生物化学分析仪进行检测。

5．统计学处理：数据均用SPSS13.0软件包进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（x-±s）表示，所有数据先行正态性和方差齐性检验, 两组数据比较采用独立样本t检验或t′检验；相关性分析用Pearson分析，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1．外周血Th17/CD4+ T细胞检测结果：对照组Th17/CD4+ T细胞比例为0.58%±0.20%，实验组Th17/CD4+ T细胞比例为0.83%±0.57%，两组比较，t＝2.47，P＝0.017，差异有统计学意义。

2. 血清IL-17A和GGT、ALP水平检测结果：PBC患者血清IL-17A水平为（24.6±9.7）pg/ml，对照组血清IL-17A水平为（18.0±2.1）pg/ml，两组比较，t＝3.94，P<0.01，差异有统计学意义；实验组GGT浓度为（317±267）U/L，对照组GGT浓度为（23±12）U/L，两组比较，t＝6.50，P<0.01，差异有统计学意义。实验组ALP浓度为（246±156）U/L，对照组ALP浓度为（60±13）U/L，两组比较，t＝7.08，P<0.01，差异有统计学意义。

3．血清IL-17A水平与GGT、ALP浓度的相关性分析结果：实验组血清IL-17A水平与GGT、ALP浓度呈正相关，r值分别为0.826、0.665，P值均<0.05，差异均有统计学意义；对照组血清IL-17A水平与GGT、ALP浓度相关性分析，r值分别为0.055、0.056，P值均>0.05，差异无统计学意义。

三、讨论

Th17细胞是CD4+ T细胞的一种独立亚型，它特异性分泌的IL-17A是一种促炎性很强的细胞因子。Th17细胞和IL-17A已被证实在某些自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、银屑病等)中发挥重要作用[2-3]。Lan等[4]研究发现，PBC患者肝组织中有大量IL-17A阳性淋巴细胞浸润；正常小鼠脾脏CD4+ T细胞和肝实质细胞共同培养时能分泌更多的IL-17A，与单独培养脾脏CD4+ T细胞分泌的IL-17A相比，差异有统计学意义，提示Th17细胞在肝细胞微环境中参与肝脏自身免疫炎症过程。

既往认为，Th1细胞通过分泌炎性细胞因子干扰素γ介导多种自身免疫性疾病。新近发现，中和或敲除Th1细胞型干扰素γ基因表达的动物模型，小鼠自身免疫性炎症非但不减轻，反而更加严重；而采用抗IL-17A治疗后能够减轻炎症程度，说明分泌IL-17A的Th17细胞在自身免疫性疾病中发挥重要作用[5-6]，也对过去我们认为Thl细胞的作用提出了挑战。Th17细胞能特异性分泌炎性细胞因子如IL-17A、IL-6、IL-22和肿瘤坏死因子α等，但不产生干扰素γ和IL-4。IL-17A具有强大招募中性粒细胞的生物学作用，并且能使趋化因子如IL-8、单核细胞趋化蛋白和转化生长因子α的分泌增高，加强致炎效应，引起组织损伤[7-8]。

本研究中，实验组外周血Th17细胞及IL-17A水平高于对照组，差异有统计学意义，这与Lan等[4]的动物模型研究结果相符。IL-17A是Th17细胞分泌的主要炎性细胞因子，它们在PBC患者外周血中表达水平明显高于正常人，提示Th17细胞可能是通过血液循环到达肝脏组织，介导自身免疫反应，并分泌炎症细胞因子参与PBC肝组织炎症的发生，或者是炎性损伤的肝细胞微环境会更易诱导Th17细胞的产生并释放到血液循环中。确切的作用机制尚待进一步研究。

胆汁淤积，肝细胞过度生成GGT和ALP，经淋巴管和肝血窦进入血流，导致血清GGT和ALP增高。所以GGT和ALP与胆汁淤积最密切相关，是反映胆汁淤积慢性肝病严重程度的重要实验指标[9]；GGT还反应肝脏的病理损害程度，与肝组织炎症呈明显的相关性[10]。实验组血清GGT、ALP表达水平与对照组相比，差异有统计学意义；PBC患者血清IL-17A水平与GGT、ALP浓度呈正相关，而对照组血清IL-17A水平与GGT、 ALP浓度则无相关性，表明IL-17A与PBC患者胆管上皮细胞损伤的严重程度以及纤维化形成和进展具有一定的关系。由此推测Thl7细胞作为一种新发现的病理性效应T细胞可能通过IL-17A的促炎效应，参与机体病理性免疫应答和加强细胞毒性反应，释出自身抗原，参与PBC中胆管上皮细胞和肝细胞破坏的发病过程。

PBC中小叶间胆管上皮细胞及胆小管结构的破坏是由T细胞浸润所致，其中自身反应性T细胞在PBC疾病进展中起主要作用[11］。然而抗原特异性T细胞在PBC患者体内激活与过度活化原因和确切机制目前仍不清楚。近年来PBC发病呈上升的趋势，尚无特效治疗，抑制异常免疫反应乃是治疗的关键。Th17细胞为新的CD4+ T细胞亚群，在PBC患者体内如何过度增殖及其它分泌的IL-17A的信号封闭点，确切机制尚不清楚。

本研究结果显示Th17细胞与IL-17A在PBC患者中高表达，为进一步研究Th17细胞/IL-17A信号通路在PBC发病机制中的作用提供实验依据。随着Th17细胞及IL-17A在自身免疫肝病的研究，Th17细胞/IL-17A作用轴，有望成为PBC患者重建免疫系统的新靶点,并为PBC的临床治疗提供新的策略。

志谢    本研究PBC病例采集和临床资料收集得到中山大学附属第三医院检验科免疫室梁敏坚主任大力帮助，特此志谢！

参  考  文  献

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沈宏辉，赵景民，辛绍杰，等.慢性乙型肝炎患者血清生物化学指标对肝组织炎症程度的评估价值.中华肝脏病杂志,2009,17:12-15.

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（收稿日期：2009-11-09）

（本文编辑：孙宇航）

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