【摘要】 目的 探讨极限门静脉压力分支结扎对大鼠肝脏基质金属蛋白酶（MMP）及其组织抑制因子（TIMP）表达的影响。 方法 Sprague-Dawley雄性大鼠96只，随机分成假手术对照组和门静脉结扎实验组。观察术后0.5、1、3、5、7、14、21d和28d保留侧肝脏和肝脏总质量变化，光学显微镜下观察保留侧肝细胞的形态变化，用免疫组织化学方法检测保留侧肝细胞的增殖细胞核抗原（PCNA）及MMP2、MMP9和TIMP2的表达。用SPSS11.5统计软件根据不同数据资料进行t检验或Pearson相关分析进行统计学分析。 结果 （1）90%极限门静脉分支结扎后，95.8%的大鼠存活良好。结扎侧肝叶呈进行性萎缩、变小，保留侧肝叶占总肝质量的比例在1d内增加较缓慢，而1～5d时，保留侧肝叶所占比例则增加速度明显加快，5d以后保留侧肝叶所占比例增加变慢，于7d达“平台期”；(2）术后PCNA阳性细胞计数与假手术对照组比较，门静脉结扎实验组术后0.5～3d明显增多，0.5、1、3d组PCNA阳性率分别为13.86%±4.73%、17.45%±4.38%、21.33%±5.59%对比7.33%±2.63%、9.42%±3.98%、8.13%±2.37%，P值均<0.01，第5天达高峰（25.70%±6.80%对比6.37%±3.38%），第7天有所减少，但仍高于对照组（P值均<0.01），以后逐渐恢复正常；（3）保留侧肝叶的MMP2、MMP9和TIMP2蛋白的表达均在术后1d开始明显增加, 至术后7d达高峰;此后逐渐恢复至术前水平（P>0.05)，仅见少量肝细胞胞质表达；（4）大鼠肝脏MMP2的表达在术后0.5、1、5、7、14d组与肝组织PCNA表达均呈正相关关系, MMP9的表达在术后0.5、1、7、21d组与肝细胞PCNA指数呈正相关关系,大鼠肝脏TIMP2的表达在术后1、7、14、21d组与肝细胞PCNA指数呈正相关关系。 结论 90%极限门静脉分支结扎术后保留侧肝叶的MMP2、MMP9和TIMP2蛋白的表达均在术后1d开始增加, 至术后7d达高峰；此后逐渐恢复至术前水平；术后PCNA指数与保留侧肝叶的MMP2、MMP9和TIMP2蛋白的表达明显相关，MMP2、MMP9和TIMP2蛋白在肝再生的过程中发挥重要作用。 【关键词】 肝再生； 门静脉； 结扎； 基质金属蛋白酶； 基质金属蛋白酶组织抑制因子 Effect of 90 percentage portal branch ligation on liver regeneration and expression of matalloproteinase and tissue inhibitors of metalloproteinases in rats LI Ke-zhou, YAO Yu-tong, LUO Le, ZHANG Xiao, RONG Cheng, LUO Zhu-lin, YAN Hong-tao, ZHU Yong-qiang,TIAN Fu-zhou. General Surgery Center of PLA, General Hospital of Chengdu Military Region, Corresponding author: 【Abstract】 Objective To investigate the effect of 90% portal branch ligation on liver regeneration and expression of metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in rats. Methods Ninety-six SD rats were randomly divided into Sham-PBL group and portal vein branches ligation group. The weight of both ligated and unligated lobes of liver were measured at post operation day (POD) 0.5, 1, 3, 5, 7, 14, 21 and 28. The morphological changes of the non-ligated liver lobes were observed by microscope. The expression of PCNA, MMP2, MMP9 and TIMP2 of the non-ligated liver lobes were studied by immunohistochemistry. Results 1) 95.8% rats survived from the ligation of 90% portal branch. Hepatic lobe at the ligated side diminished progressively after ligation, whereas the lobes of the unligated side underwent compensatory regeneration. The ratio of non-ligated lobes weight to the whole liver increased slowly within 1d, speeded up significantly during 1-5d period, increased slowly after POD5, and got the plateau stag at POD7; 2) PCNA index were markedly increased within POD 0.5-3 (P < 0.01). It reached the peak at POD5 and decreased slightly at POD7, but still higher than Sham-PBL group level, then gradually returned to normal. 3) The expression of MMP2,MMP9 and TIMP 【Key words】Liver regeneration; Portal; Ligation; Matrix metalloproteinases; Tissue inhibitors of metalloproteinases 细胞外基质（ECM）重新构型是肝再生过程中的重要步骤[1]。基质金属蛋白酶（MMPs）以酶原方式分泌于细胞外间隙,广泛参与ECM的降解,其中MMP2、MMP9可以降解许多胶原包括基底膜（Ⅳ型胶原）、变形纤维性Ⅰ型胶原及Ⅴ型胶原,在基质降解中发挥着重要的作用[2]。我们采用大鼠90%极限门静脉分支结扎（portal branch ligation，PBL）模型，于术后不同时间点（0.5、1、3、5、7、14、21d和28d）测量非结扎侧肝脏和肝脏总质量，观察光镜下形态、肝细胞增殖及肝脏组织中MMP2、MMP9和基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）2的表达变化，进而来探讨极限门静脉压力分支结扎对大鼠肝脏再生和MMP及TIMP表达的影响。 材料与方法 1. 主要试剂：兔抗大鼠MMP2多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗大鼠MMP9多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗大鼠TIMP2多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司,小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原（proliferative cell nuclear antigen，PCNA）单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（S-P）免疫组织化学超敏试剂盒及DAB显色剂购自福州迈新生物技术开发有限公司。 2. 实验动物分组及处理：雄性Sprague-Dawley大鼠96只，体质量（220±20）g，由四川大学华西医学实验动物中心提供。动物在控制温度、湿度及12h照明与12h黑暗交替的环境中喂养, 并允许随时自由食用固定标准饲料饮食和清水。实验大鼠随机分为2组：（1）假手术对照组（Sham-PBL group）：48只。（2）90%极限门静脉分支结扎组（PBL group）：48只。每个实验组又随机分为8个亚组，每组6只，分别为术后0.5d组、1d组、3d组、5d组、7d组、14d组、21d组和28d组。采用1.5%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉。参照文献[3]方法，由正中纵切口入腹腔,在手术显微镜下仔细分离出供应肝右叶及尾叶的门静脉右支和供应左外叶及中叶的门静脉支,分别用4-0丝线结扎。只留下一细小的通向二乳突叶的门静脉支未结扎，肝动脉及胆管保持完整。被结扎侧肝脏约占全肝质量的90%。假手术组仅游离出门静脉分支，不结扎即关腹。所有手术均为清洁手术，均在上午8∶00～12∶00完成。术后定时观察两组动物的存活情况。 3. 肝脏大体结构观察：将取出的完整肝脏以滤纸吸干血液。观察肝脏的色泽和质地，用电子天平分别测量各组大鼠的肝总质量和乳突叶（非结扎侧肝叶）质量（精确到 4. 光学显微镜观察：取各时相点肝未结扎侧肝叶的肝脏组织，用10%甲醛液固定，常规石蜡包埋切片，HE染色观察肝脏病理结构的改变。 5. 肝细胞增殖的检测：采用免疫组织化学S-P法对保留侧肝叶肝细胞增殖进行检测分析，S-P免疫组织化学染色按试剂盒说明书进行。PCNA工作浓度为1∶100，切片均采用微波修复抗原,加入第一抗体 6. 肝组织MMP2、MMP9和TIMP2表达检测：采用免疫组织化学S-P法对保留侧大鼠肝叶肝脏组织中MMP2、MMP9和TIMP2进行检测。S-P免疫组织化学染色按试剂盒说明书进行。MMP2工作液浓度为1∶200，MMP9工作液浓度为1∶100, TIMP2工作液浓度为1∶50。所有切片均采用微波修复抗原,加入第一抗体 7. 统计学方法：所有实验数据用均数±标准差（x-±s）表示，用SPSS11.5统计软件进行t检验。检验水准α＝0.05。相关性采用Pearson相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。 结 果 1. 90% PBL术后大鼠存活率及肝脏质量的变化：48只90% PBL实验组大鼠中46只存活（21d组和28d组各死亡1只），总存活率为95.8%。结扎侧肝叶肝脏颜色变暗，逐渐开始萎缩，保留侧肝叶占总肝质量的比例随时间推移而增加，术后0.5d内增加较缓慢，而1～5d则增加速度明显加快，5d以后呈缓慢增加，7d达“平台期”，质量比例增加进一步变缓。全肝总质量仅在术后第1～3天略低于对照组，其余时间点则与对照组接近，差异无统计学意义（表1）。 2. 肝脏组织的病理变化：对照组大鼠肝脏显示以中央静脉为中心肝细胞呈放射状排列。PBL组术后保留侧肝脏显示：术后0.5d肝细胞轻度肿胀，汇管区、小叶间血管、胆管界限清楚；术后第l天肝细胞即开始明显增殖，有较多的分裂相存在，伴有核增大，汇管区、小叶间血管扩张充血；术后3～5d肝细胞核分裂活跃，汇管区见炎症细胞浸润；术后第7～14天亦可见较多的分裂相，肝细胞核增大；术后第21～28天可见间质少量炎细胞浸润。小胆管增生，肝索结构清楚，肝窦清楚（图1～图3）。 3. 再生肝脏肝细胞增殖的检测结果：PCNA染色核呈棕黄色。对照组大鼠的肝组织中有少量PCNA表达。PBL组术后保留侧肝组织0.5d开始，PCNA的表达量即明显增加（P<0.01）, 可见较多PCNA阳性细胞；至术后5d达高峰（P<0.01), 可见大量PCNA阳性细胞;自7d至14d逐渐下降,但仍高于正常水平（P<0.05)，术后21d恢复至术前水平（P>0.05)，仅见少量PCNA阳性细胞（图4，5，表2）。 4. 肝组织MMP2、MMP9和TIMP2蛋白表达的变化：MMP2、MMP9和TIMP2蛋白主要在肝组织的细胞质中表达。PBL组保留侧肝叶0.5d组肝组织的细胞质可见少量MMP2、MMP9和TIMP2蛋白表达，PBL组保留侧肝组织从1d开始，MMP2、MMP9和TIMP2蛋白的表达量明显增加；至术后7d达高峰；此后逐渐恢复至术前水平（P>0.05)，仅见少量肝细胞胞质表达（图6～图11，表2）。 5. 大鼠肝脏PCNA与MMP2、MMP9和TIMP2表达的相关性分析：大鼠肝脏MMP2的表达在术后0.5、1、5、7、14d组与肝组织PCNA表达均呈正相关关系,r值分别为0.895、0.932、0.924、0.846、0.915（P值均<0.05）；在其他各时间点，两者表达无相关性；大鼠肝脏MMP9的表达在术后0.5、1、7、21d组与肝细胞PCNA指数呈正相关,r值分别为0.945、0.918、0.861、0.893（P值均<0.05）；在其他各时间点，两者表达无相关性；大鼠肝脏TIMP2的表达在术后1、7、14、21d组与肝细胞PCNA指数呈正相关，r值分别为0.847、0.915、0.931、0.862（P值均<0.05）；在其他各时间点，两者表达无相关性。 讨 论 既往研究表明大鼠能很好地耐受70%门静脉分支结扎或栓塞[4]。门静脉分支结扎或栓塞预处理后行二期肝切除术在肝癌临床患者的治疗上也取得了较好的疗效[5]。而本研究结果显示, 90%极限门静脉分支结扎是可行的，也为对晚期特大肝癌和广泛肝内胆管结石患者手术前预先进行预处理而避免肝衰竭的发生提供了实验依据。 PCNA是评价肝脏再生的一个重要指标。本研究结果表明，90%门静脉分支结扎后，肝组织PCNA的表达量从0.5d开始呈显著增加，可见较多PCNA阳性细胞；至术后5d达高峰, 可见大量PCNA阳性细胞；自术后7～14d逐渐下降，但仍高于正常水平，术后21d恢复至术前水平，仅见少量PCNA阳性细胞。这与经典的部分肝切除模型所得出的结论基本相同，也说明90%极限门静脉分支结扎术也可作为一种理想的研究肝脏再生动物模型。 ECM不仅是细胞赖以生存的场所，而且是细胞与细胞之间自分泌和旁分泌调节的必经之路和缓冲地带，其变化受MMP和TIMP的调节。正常情况下，MMP主要降解ECM，TIMP主要抑制MMP的活性，从而抑制ECM 降解。二者表达的平衡是维持正常肝组织中ECM合成与降解动态平衡的关键。肝再生过程中尿激酶被激活，尿激酶裂解血浆纤溶蛋白酶原生成血浆纤溶蛋白酶，后者溶解纤溶蛋白，激活一系列基质相关金属蛋白酶，其中MMP2、MMP9的激活在肝再生过程中具有重要作用[1, 6]。敲除MMP9基因的小鼠肝再生不能正常进行[7]。 本研究结果提示，MMP2、MMP9、TIMP2蛋白与肝再生密切相关，三者参与再生肝组织的结构改建，形成新的肝血窦及肝小叶，恢复肝组织的正常结构。这也与其他学者通过部分肝切除及肝纤维化模型所得出的结论基本相同[8-9]。 本研究结果提示，MMP2、MMP9和TIMP2与肝再生的启动和增殖过程密切相关。对此深入研究，对于指导肝脏外科对肝切除术后残肝的再生修复及肝移植的临床治疗具有极其重要的意义。 参 考 文 献 [1]Kim TH, Mars WM, Stolz DB, et al. Expression and activation of pro-MMP-2 and pro-MMP-9 during rat liver regeneration. Hepatology, 2000, 31: 75-82. [2]Roderfeld M, Geier A, Dietrich CG, et al. Cytokine blockade inhibits hepatic tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression and up-regulates matrix metalloproteinase [3]Gaub J, Iversen J. Rat liver regeneration after 90% partial hepatectomy. Hepatology, 1984, 4: 902-904. [4]Furrer K, Tian Y, Pfammatter T, et al. Selective portal vein embolization and ligation trigger different regenerative responses in the rat liver. Hepatology, 2008, 47: 1615-1623. [5]Hatsuno T, Kaneko T, Inoue S, et al. Changes in hepatic lobe volume in hepatocellular carcinoma after transcatheter arterial and percutaneous transhepatic portal embolization. Hepatogastroenterology, 2004, 51: 1820-1824. [6]Pr閍ux AM, Mallat A, Nhieu JT, et al. Matrix metalloproteinase-2 activation in human hepatic fibrosis regulation by cell-matrix interactions. Hepatology, 1999, 30: 944-950. [7]Olle EW, Ren X, [8]Knittel T, Mehde M, Kobold D, et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-alpha and TGF-beta1. J Hepatol, 1999, 30: 48-60. [9]Watanabe T, Niioka M, Hozawa S, et al.Gene expression of interstitial collagenase in both progressive and recovery phase of rat liver fibrosis induced by carbon tetrachloride. J Hepatol, 2000, 33: 224-235. (收稿日期： （本文编辑：金生） |