【关键词】肝炎病毒，丙型； 肝炎，丙型； 免疫学 Hot issues of immunology in viral hepatitis C ZHAO Fu-tao, JIA Zhan-sheng. 【Key words】Hepatitis C virus; Hepatitis C; Immunology 【First author’s address】Center of Diagnosis and Treatment for Infectious Diseases of PLA, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710038, China Corresponding author: JIA Zhan-sheng, Email: jiazsh@ fmmu.edu.cn 目前，长效α干扰素和利巴韦林联合应用作为丙型肝炎治疗的“标准方案”，其持久病毒学应答率只有50%，而且不良反应大，费用昂贵，停止治疗后仍有很高的复发率[1]。由于HCV的基因组变异率高，缺乏有效的细胞和小动物感染模型，对其细胞免疫和体液免疫在HCV感染恢复中的作用认识仍然不是十分清楚，使得以诱导保护性抗体产生为目的的预防性疫苗和（或）治疗性疫苗的研究也步履艰难[2]。因此，探讨HCV感染过程中的特异性免疫的细胞和分子机理，寻找有效的抗病毒治疗药物和研制HCV疫苗，一直是研究的热点[3]。 一、HCV感染对机体免疫系统的影响 在外来病原体及肝内自身代谢产物等抗原物质的免疫原性及免疫细胞的抗原提呈作用下，肝脏不仅可以诱导免疫耐受或炎症反应，而且还可以通过促炎症因子的释放调节免疫反应的进程及诱导凋亡。 1. HCV干扰肝脏固有免疫的分子机制: 研究证实，HCV蛋白，如C、E2、NS3/ 2. HCV对适应性免疫的影响：HCV病毒蛋白除了干扰固有免疫应答，还通过多种机制影响宿主的适应性免疫应答[8]。（1）HCV结构和非结构蛋白抑制T淋巴细胞的功能导致CD4+ T淋巴细胞功能丧失。如HCV核心蛋白通过与T淋巴细胞表面受体gC1q结合，从而抑制T淋巴细胞的增殖和白细胞介素（IL）-2的产生。HCV NS5B由于具有易错RNA聚合酶活性，能产生高度的病毒变异，从而逃逸适应性免疫应答。（2）CD4+CD25+Foxp3+调节性T淋巴细胞（Treg细胞）活性增强。Boettler等[9]通过缺失和共培养研究实验发现CD4+CD25+ Treg细胞以剂量依赖性的方式并分泌IL-10从而抑制HCV特异性CD8+ T淋巴细胞的增殖和IFNγ及穿孔素的产生。Fields等[10]研究发现，在Th1/Th2的辅助下，体内B淋巴细胞在过继转移后的第8天开始分泌抗体，当有CD4+CD25+ Treg细胞存在时，Th细胞的活化及定位不受影响，而抗体生成受到明显抑制。耗竭CD4+CD25+ Treg细胞能促进HCV特异性T淋巴细胞的增生活化，而且CD4+CD25+ Treg细胞的数量与HCV RNA的滴度呈正相关，与肝脏炎症程度呈负相关。而在丙型肝炎恢复者与健康献血者中，CD4+CD25+ Treg细胞的抑制活性明显降低。（3）HCV特异性CD8+ T淋巴细胞“耗竭”（T cell exhaustion)。NS5B与其他NS蛋白结合形成复合物，以病毒正链RNA为模板合成负链RNA。NS5B有膜锚基位点，可以固定在细胞内质网上，因此，NS5B可以与囊泡转运蛋白hVAP33结合，下调一些蛋白如组织相容性（抗原）复合物-1在细胞膜表面的表达，降低宿主的抗原呈递，抑制T淋巴细胞的细胞毒作用，从而降低了机体对病毒及其感染肝细胞的清除。另外，HCV还可以通过多种抑制性受体，如程序性死亡蛋白-1（programmed cell death-1，PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4等，导致丙型肝炎特异性CD8+ T淋巴细胞“耗竭”。 3. 肝脏免疫细胞对HCV的控制作用:机体的免疫应答在一定条件下发挥有效的抗病毒作用。大多数情况下，HCV持续复制与人体抗病毒免疫应答相互影响，导致丙型肝炎的发生、发展。外源干扰素抗病毒治疗相当于增强了机体固有的抗病毒免疫反应。在肝内，固有免疫是控制HCV的第一道防线，多种细胞参与抗HCV的固有免疫，如单核细胞、吞噬细胞、浆细胞样DC和髓系DC、中性粒细胞、NK和NKT[4]。 NK/NKT淋巴细胞大量富集于肝脏，在肝脏抗病毒感染中起着十分重要的作用。它们通过释放大量细胞因子，从而直接杀伤HCV感染肝细胞，抑制HCV复制。Ye等[11]研究了CD56+ T淋巴细胞在控制HCV感染中的作用。研究表明，CD56+ T淋巴细胞通过分泌干扰素γ，从而激活Janus激酶（JAK）/STAT途径，增强IRFs和STATs的表达，导致胞内干扰素α/β和抗HCV 微小RNAs的诱导表达。这在分子水平上直接证明了CD56+ T淋巴细胞能抑制肝细胞HCV的感染和复制。这些结果为CD56+ T淋巴细胞介导的抗HCV活性提供了一种新的机制，从而设计基于CD56+ T淋巴细胞为基础的干预策略，进而在肝细胞中HCV的胞内控制和清除中发挥重要作用。 二、固有免疫的模式识别受体与HCV感染 机体对HCV的识别是免疫应答的基础。目前发现识别HCV RNA病毒的模式识别受体主要有：Toll样受体家族（toll-like receptors, TLRs）和RIG-Ⅰ样受体家族（retinoic acid-inducing gene I-like receptors, RLRs）[12]。 1. TLRs: HCV能够通过多种机制逃避宿主的干扰素反应，如NS3/ TLR7和TLR9在宿主抗病毒反应中起重要作用，是目前治疗病毒性疾病的主要靶位。TLR7配体可通过干扰素和非干扰素两种途径诱导抗HCV免疫反应。因此，TLRs配体可能具有比干扰素更强的抗病毒活性，尤其是对干扰素治疗无应答者。一种TLR7配体——7-硫代-8-氧化鸟嘌呤 (ANA-245)对患者进行全身给药后，显示出明显的剂量依赖性免疫诱导作用，且不良反应很轻微。此外，另一种TLR7配体9-苯基-8羟基-2-腺嘌呤（SM360320）可明显降低Huh-7细胞内HCV RNA水平。TLR7, TLR9促效剂（CPG10101）和CpG-寡核苷酸也展现出可喜的抗HCV活性[13]。 2. RIG-Ⅰ样受体家族：RLRs是一类新发现的模式识别受体，能够识别细胞质中的病毒RNA，通过RLR级联信号诱导IFN和促炎症细胞因子的产生，对抗病毒固有免疫的建立起着非常重要的作用。RLR信号通路既受宿主的严格调控，也能够作为病毒逃避宿主IFN反应的靶点发挥作用。 Lin等[14]的研究结果显示，HCV能够通过NS3/ 另外，最近新发现一类NOD样受体家族［nudeotide oligmerization domain（NOD）-like receptors, NLRs］，可以作为细胞内的模式识别受体，能识别侵入胞质内的病原微生物，其中一个NACHT富亮氨酸重复序列和PYD结构域蛋白3识别dsRNA，并通过转换器凋亡相关的斑点样蛋白ASC 诱导caspase-1的催化活性，从而启动固有免疫应答。 目前，TLR依赖途径对丙型肝炎固有免疫应答的调控研究已相对成熟，对TLR非依赖途径的调控研究也日渐深入。因此，通过对这两条途径更为深入的理解，必将有助于获得更多的有价值的免疫活性佐剂物质，这对于研制出更为安全有效的疫苗具有重要意义。 三、Treg细胞和Th17细胞在HCV感染中的免疫调节作用 Treg细胞既可以防止免疫系统对自身抗原的反应，防止自身免疫性疾病的发生，又可以诱导机体对移植物、病原体乃至肿瘤产生免疫耐受，这是导致病毒慢性感染及肿瘤逃避免疫系统监视的重要原因，同时也为相应的治疗提供了细胞生物学基础[17]。 1. Treg细胞介导免疫抑制作用的机制:Treg细胞是一群增殖能力低、具有免疫抑制功能的细胞。Treg细胞主要由几类T淋巴细胞亚群组成，如Th3细胞、Tr1细胞、CD8+Treg细胞和无能细胞等，以及最近发现的CD4+CD25+ Treg细胞。近年来的研究表明，Treg细胞在HCV慢性感染的发病机制中起重要作用。 研究表明，Treg细胞介导免疫抑制作用的机制如下：（1）Treg细胞分泌转化生长因子β（TGFβ）、IL-10和IL-35等抑制性细胞因子。其中TGFβ具有直接介导免疫抑制的作用，使反应性T淋巴细胞对Treg细胞抑制作用更加敏感，并且维持Treg细胞本身Foxp3表达和发挥抑制作用。（2）通过细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体介导的细胞直接接触的抑制作用。Treg-DC通过竞争初始T淋巴细胞与DC的接触，从而下调DC的CD80/CD86表达，降低DC的抗原提呈功能。（3）颗粒酶或穿孔素依赖机制：通过杀伤或灭活反应性T淋巴细胞，从而抑制特异性细胞免疫应答[18]。 HCV患者中，在适当的保护性免疫应答和抑制性的免疫病理应答这两者之间，Treg细胞起着调节平衡的作用。Franceschini等[19]研究了HCV患者Treg细胞功能的调节。他们发现，在慢性丙型肝炎感染者，同CD4+CD25+Foxp3-效应性T淋巴细胞相比，Treg细胞在肝内呈相对低水平表达。这种低水平表达，同肝内PD-1表达的上调呈一致性。而PD-1的表达同Treg的增殖和体内免疫抑制的临床标志物呈负相关。另外，阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用增加了从丙型肝炎患者肝内分离出来的Treg细胞的扩增数量和功能。在丙型肝炎患者肝内分离出来的Treg细胞培养中，阻断PD-L1能够上调STAT-5的磷酸化。这些结果表明，在慢性丙型肝炎感染患者中，PD-L1通过控制STAT-5的磷酸化从而负性调节Treg细胞。 Bolacchi等[20]和Cabrera等[21]的研究表明，持续性HCV感染增加了循环中CD4+CD25+Treg细胞的数量，并直接抑制HCV特异性CD8+T淋巴细胞的活性。Tajimi等[5]则进一步证实了在HCV慢性患者中，出现了针对HCV核心抗原及NS3抗原的抗原特异性Treg细胞，这种抗原特异性Treg细胞的诱导生成加重了HCV的感染。Boyer等[22]的研究表明，在慢性感染HCV的患者中，30%～50%的患者会并发自身免疫性疾病——混合冷球蛋白血管炎，而且10%～15%的患者会发展成系统性重度自身免疫病，与未发病的HCV患者相比，严重并发混合冷球蛋白血管炎的HCV患者，其CD4+CD25+ Treg细胞在外周循环中的数量明显下降，甚至低于健康人群。这可能是由于CD4+CD25+ Treg细胞过多聚集于炎症区域，在抑制炎症反应的同时却导致了外周循环的Treg细胞数量下降，从而减弱了其抑制自身免疫的能力，进而导致了HCV患者并发混合冷球蛋白血管炎。这从一个方面解释了为什么病毒感染会导致自身免疫性疾病，另一方面也揭示了CD4+CD25+ Treg细胞在免疫中的微妙调节作用。 2. Th17细胞在HCV免疫调节中的作用：Rowan等[23]研究了Th17细胞在丙型肝炎免疫调节中的作用。他们的研究表明，正常人IL-10和TGFβ抑制CD4+细胞产生IL-17。HCV患者抗原特异性Th17细胞由IL-10和TGFβ调节。HCV特异性Th17细胞由病毒诱导的TGFβ抑制，而且，HCV特异性Th17细胞的活性下降。HCV NS4蛋白诱导HCV患者外周血单个核细胞产生IL-17、IFNγ、IL-10和TGFβ水平明显高于正常对照。并且，抗TGFβ中和抗体可以促使HCV患者抗原特异性Th17细胞产生细胞因子。同时，iTreg细胞和Th17细胞亚群可以相互转化[24]。研究结果提示，HCV NS4所诱导产生的固有抗炎症细胞因子IL-10和TGFβ能抑制丙型肝炎特异性Th1和Th17细胞的产生。 因此，若能抑制调节性T淋巴细胞的增殖和分化，或阻断其调控途径，如剔除调节性T淋巴细胞的过继治疗，抗CD25单抗的治疗，阻断细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4的治疗或针对特异性转录因子Foxp3的基因治疗等，或许能够阻断其免疫抑制功能，为慢性HCV感染的治疗寻找到新的靶分子。 四、对HCV中和抗体的重新认识 HCV在急性感染过程中可能通过某种机制延缓中和抗体的产生，建立慢性感染。急性感染者体内存在的中和抗体及活性与患者体内病毒载量有关，并可预示患者的转归。但在应用人肝-小鼠嵌合HCV感染模型和黑猩猩感染模型研究发现，中和抗体具有很好的保护作用。 1. 抗HCV中和抗体的发现和检测方法：作为适应性免疫的第一道防线，体液免疫尤其是中和抗体在阻断HCV感染和免疫清除中的作用，长期以来一直困于没有简易有效的检测与评价手段。自HCV克隆成功以后在黑猩猩证明有抗HCV中和抗体的存在。其保护效应由于缺乏检测系统和有效的细胞模型未能受到广泛重视。过去对中和抗体的评价，缺乏有效的手段，使预防疫苗的发展受阻。近年来发展起来的HCV包膜糖蛋白假病毒颗粒（HCVpp）和HCV细胞培养模型（HCVcc），作为受体的研究、中和抗体的评价及疫苗的评价工具，发挥了重要作用。上述两个系统的建立和应用，能使关于中和抗体的研究获得可靠的实验数据。 HCVpp和HCVcc的成功建立为中和抗体的检测提供了技术保障。HCV体外培养模型愈来愈接近HCV感染的自然状态，大大促进对HCV病毒颗粒的入胞、复制、组装、释放等环节和其致病机制的研究。HCV假病毒颗粒呈现出嗜肝性且可被抗-E2的mAb或HCV患者血清中和，因此，可用作研究HCV感染早期特性（如宿主嗜性、受体结合、膜融合及血清中和等）的有效模型。 2. HCV中和抗原表位与广谱中和抗体的意义:体液免疫尤其是以中和抗体为主的保护性抗体，在阻断病毒感染、抑制病毒复制的过程中发挥着关键作用，通过自然感染或人工免疫途径所建立的中和抗体反应是抗病毒免疫保护的重要组成部分，并为细胞免疫最终清除病毒及感染细胞创造了条件。近年来，随着研究的不断深入，人们对HCV免疫保护的认识有了新的进展。 以前认为，丙型肝炎病毒高变区（HCV HVR）1是中和抗体的重要靶位点，HVR1的B细胞中和表位包括400～409aa，398～410aa，399～405aa。新近研究发现，在HCV HVR1之外，HCV E2包膜蛋白下游还存在数个中和表位，此类中和表位可能位于同宿主细胞受体结合的区域或是对包膜蛋白结构或功能至关重要的部位，具有一定的保守性；针对这些表位所诱导的中和抗体在体外实验中能中和多株不同亚型的丙型肝炎假型病毒，具有广谱交叉中和活性。另外，HCV感染者尤其是慢性感染者体内可检测到广谱交叉中和抗体，来自慢性感染者的血清或用其制备的免疫球蛋白通过被动免疫可以预防HCV感染。尤其值得指出的是，最新研究还发现，在HVR1下游附近（412～423）包含一个在已知6种HCV基因型中均高度保守的线性中和表位，其mAb AP33能在体外中和所有6种基因型的HCV假病毒[25]。这一线性广谱交叉中和表位为HCV预防与治疗性疫苗的研制带来了新的希望。此外，目前还发现包膜蛋白E1上存在中和抗原表位。因此，类似的中和抗原表位仍有待发现，并将极大地推动HCV保护性免疫机制的研究。 具有广谱中和活性抗HCV人源单克隆抗体的鉴定，对于HCV病毒与宿主之间相互作用的更多理解以及具有高效被动免疫疗法的疫苗的设计是非常重要的。Perotti等[26]最近鉴定了一个人源单克隆抗体Fab（e137），其能够与除了基因型5之外的所有HCV基因型中的HCV E2包膜糖蛋白相结合。抗体竞争分析结果和对E2蛋白丙氨酸突变的反应性测定表明，e137抗原表位包括所有HCV基因型中高度保守的残基（T416，W420，W529，G530和D535）。Fab e137能够中和HCV基因型 总之，深入理解丙型肝炎病变和宿主相互作用的免疫学机制，如HCV与脂蛋白的结合、免疫逃逸机制、DC和T淋巴细胞的相互作用、丙型肝炎患者体内耐受状态以及免疫失能等，将极大地促进丙型肝炎新的治疗方法、药物和疫苗的研究进展。 参 考 文 献 [1]Tai AW, Chung RT. 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