【关键词】肝炎病毒，乙型； 动力学； 共价闭合环状DNA Dynamics of HBV covalently closed circular DNA: amplification and clearance ZHAO Ke-kai, MIAO Qian-li, MIAO Xiao-hui. 【Key words】Hepatitis B virus; Dynamics; Covalently closed circular DNA 【First author’s address】Department of Infectious Diseases, No. 404 Hospital of PLA, Weihai Email: zkk404@163.com HBV基因组是一种松弛环状的双链DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）分子，其两条链均不闭合，在病毒的复制过程中，病毒DNA进入宿主细胞核，两条链的缺口被补齐，形成超螺旋的共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）。cccDNA是HBV在肝内进行复制的原始模板，虽然其含量较少，但对病毒在宿主细胞内感染状态的建立以及维持病毒在细胞内的复制过程具有十分重要的意义。 一、肝组织内cccDNA的扩增动力学 1. cccDNA在细胞核内的形成：与rcDNA不同，cccDNA位于宿主肝细胞的细胞核而非细胞质中。对慢性HBV感染者肝细胞中HBV DNA存在形式的分析结果显示，细胞质中的双链DNA分子均存在rcDNA和双链线性DNA（double-stranded linear DNA，dsl-DNA）两种形式，而胞核中则只存在3.2kb的超螺旋DNA分子，即cccDNA。 病毒进入被感染细胞后，脱去外壳蛋白并释放出rcDNA，随后rcDNA进入宿主细胞核中转变成cccDNA分子，即为cccDNA的“从头合成”(de novo synthesis)。cccDNA是HBV感染时细胞内能最早检测到的复制中间体。用鸭乙型肝炎病毒（duck hepatitis B virus，DHBV）感染鸭胚的实验结果发现，病毒进入肝细胞数小时后，在RNA和单链DNA出现之前，细胞核中即已出现cccDNA。用DHBV体外感染鸭肝细胞发现，在感染后9～12h，cccDNA即已出现。其他关于DHBV的实验也证实，细胞核内的cccDNA在感染后24h内已出现。 从rcDNA转变为cccDNA依赖的是何种酶，是cccDNA研究的关键问题之一。多数学者认为此过程依赖的是宿主细胞内的酶而非病毒的DNA聚合酶。首先，从rcDNA转变为cccDNA，一个显而易见的变化是切去负链5′端的末端蛋白（实际上是病毒的逆转录酶）和正链5′端连接的RNA帽，然后才有可能将正链和负链的各自末端连接成完整的链，这一过程显然难以由附着在负链5′端的病毒DNA聚合酶自身去完成。其次，从rcDNA变成cccDNA的过程，不只是两条链结构完整性的改变，还包括空间结构的改变，即超螺旋结构的形成，每个cccDNA分子的超螺旋数目在0～20个，超螺旋结构的形成需要具有解旋、拓扑异构等生物学活性的酶的参与，而这两种功能显然是病毒DNA聚合酶所不具备的。以原代培养鸭肝细胞为模型的实验结果证实，细胞内DHBV rcDNA转变成cccDNA的过程并不依赖于病毒的多聚酶活性。因此，通过抑制细胞内的某些酶的活性，也许可以为干预乙型肝炎患者cccDNA形成开辟一条新途径。 除通过从头合成方式转变成cccDNA之外，rcDNA尚可通过其他方式形成cccDNA。在合成子代病毒DNA的过程中形成第二链（正链）时，如果RNA引物不从DR1转位到DR2，而是从DR1位置开始引发原位引发（in-situ priming），形成的产物将不再是松弛环状的病毒基因组，而是dsl-DNA病毒基因组，所形成的病毒基因组产物约占总产物的5%～10%[1-2]。虽然此现象是通过对DHBV相关位点的突变而发现和证实的，但实际上电镜和电泳的方法已经证实了dsl-DNA形式的HBV基因组在患者血浆病毒颗粒中的存在。dsl-DNA分子可以通过非同源重组的方式合成cccDNA分子，并仍能正常转录产生前基因组RNA，但由此形成的子代DNA分子仍然是线性的双链DNA分子，并再次通过非同源重组转化成新的cccDNA分子，但每次新形成的cccDNA分子在序列上都不同于母代cccDNA分子。HBV的这种复制方式又被称为“非法复制”（illegitimate replication）。与cccDNA“从头合成”方式相比，“非法复制”的发生率虽然较低，但它的影响可能并不弱，因为这也可能是病毒除点突变之外的逃避宿主免疫乃至药物选择压力的一种“异常”的变异方式。 2．cccDNA的形成与细胞周期：关于cccDNA是在宿主细胞增殖周期的哪一个时期合成的研究结果不一。Yeh等[3]发现在能稳定产生HBV颗粒的HepG2.HBV细胞中不能检测到cccDNA，但如果用无血清培养使细胞周期同步化，然后加入10%血清，再加入细胞周期阻断剂阿非迪霉素，使细胞停留于G1期6～8d，结果在处理后第3天即可检测到cccDNA，并且4～8d内持续增加，提示HBV进入细胞后，rcDNA转变成cccDNA主要发生在G1期。但Borel等[4]发现DHBV感染的体外培养鸭胎肝细胞至少可以增殖6d，细胞内能检测到cccDNA，如果用细胞周期阻断剂丁酸钠，或阿非迪霉素阻断细胞增殖使之停留在G1期，则细胞内cccDNA含量减少，撤去阻断剂后细胞增殖又可恢复并进入S期，cccDNA含量增加，当用表皮生长因子、肝细胞生长因子或肿瘤坏死因子刺激细胞增殖时，细胞内cccDNA的含量也相应增加。对不同期细胞进行检测也发现，cccDNA主要存在于S、G2/M期细胞而非G1期细胞。该作者认为细胞增殖对cccDNA的合成有正调节作用，并可解释为何细胞在发生有丝分裂后每个子代细胞内cccDNA含量并不减少。 3．cccDNA在细胞核内的扩增过程：rcDNA进入细胞后可不断转化为cccDNA，使cccDNA不断扩增，在细胞内形成含量非常稳定的cccDNA池（pool）。如果cccDNA的扩增是通过外源病毒不断感染而实现的，则在用抗病毒药物阻断外来病毒感染时，感染细胞内的cccDNA应该能很快消除，然而事实并非如此。将能阻断DHBV感染肝细胞的药物苏拉明加到病毒感染后的细胞培养上清液中，并不能阻断细胞内cccDNA的扩增，说明cccDNA的扩增并非子代病毒重新感染肝细胞所致，而是在细胞内通过其他方式扩增。 那么，cccDNA是否能与其他DNA分子一样进行自我复制呢？原代培养先天感染的鸭肝细胞发现,8～12d后，cccDNA的含量约为初期的50～100倍，而rcDNA、ssDNA水平则仅增加2～4倍。细胞核内的cccDNA池并非是如一般的DNA分子那样，通过cccDNA的半保留复制不断增加形成的，而是通过一种细胞内通路，即在胞质中通过逆转录形成子代rcDNA分子，除大部分与蛋白质外壳组装成子代病毒颗粒外，还有一部分被重新运回到细胞核内，进而再转变成cccDNA，不断循环，最终形成含量稳定的cccDNA池。在慢性持续感染过程中，随着病毒的不断复制，cccDNA也不断增加，最终形成稳定的cccDNA池，一般认为每个持续感染状态的肝细胞内的cccDNA含量约5～50拷贝。 尽管cccDNA池形成的细胞内通路是目前得到认可的途径，也常常被用来解释某些抗病毒药物作用过程中cccDNA池含量的下降，但这个途径中存在着一个含糊不清的关键问题：细胞质中的rcDNA分子是如何回到细胞核中去的，即如何实现核转位的。由于胞质内的rcDNA分子是包裹在衣壳蛋白的病毒、以核心颗粒的形式存在的，这个过程面临的第一个问题就是rcDNA分子是在衣壳蛋白解离后自由地通过核孔进入细胞核的，还是直接以核心颗粒的形式进入细胞核然后再进行脱壳的？Guidotti等[5]以HBV核心蛋白转基因鼠为模型的研究结果显示，无论是从细胞质到细胞核，还是从细胞核到细胞质，HBV核衣壳不能通过肝细胞的核膜。尽管细胞核中有大量衣壳蛋白存在，但其中均无病毒核酸，核衣壳是在细胞核内自主组装完成的。但将HBV的核心抗原基因转染到酵母细胞模型中，用电镜技术对1421个核孔进行观察，发现HBV核衣壳可以通过核孔转位到细胞质中，转位位点位于核孔中心，且至少95%的核孔参与核衣壳的转位。Pante`和Kann[6]通过电镜观察发现，爪蟾卵细胞核膜上的核孔复合体可以允许直径达39nm的、包被有核浆素的胶体金颗粒通过，同样也允许磷酸化后的32nm和36nm的大肠杆菌表达的重组HBV核心颗粒通过。该研究小组还以洋地黄皂甙对HuH-7细胞株进行透化处理，然后分别以重组HBV和从HepG 不同研究得出的结论截然相反，因此对于含有rcDNA分子是如何回到细胞核中进行cccDNA扩增的亟待进行深入研究，因为这可能是有望阻断cccDNA进入细胞核内进行扩增的又一个重要作用环节。值得注意的是，在上述研究中，只有Guidotti等[5]的研究是以哺乳动物的肝细胞为研究对象，其他研究要么采用低等生物的卵细胞模型和酵母细胞模型，要么采用来自于肿瘤细胞模型而且经过透化处理，与哺乳动物的肝细胞在形态和功能上可能存在着较大的差距，不能排除研究模型的差异导致得出的结论截然相反的可能。 4．cccDNA池含量的调节机制：在稳定感染的细胞中，病毒cccDNA可通过调节维持在一定的水平以满足供病毒复制的需要而对细胞无毒性。理论上，这种调节可能通过细胞主导的过程或病毒主导的负反馈机制来完成。与分泌到细胞外的病毒颗粒一样，cccDNA池的含量受病毒基因产物的负反馈调节。在先天感染肝细胞原代培养中，在cccDNA显著增加的同时，病毒复制中间体或RNA水平并未增加，表明肝细胞内病毒基因表达能力下降。在持续感染组织内，基因表达产物下降可导致cccDNA合成增加、细胞核内cccDNA堆积。cccDNA池的扩大，反过来又使基因合成量增加而恢复基因产物的正常表达水平。通过这种负反馈调节机制，细胞内cccDNA的水平得以保持稳定。通过点突变方法使合成病毒包膜蛋白所需的p36和p17基因发生变异，不能合成包膜蛋白，再用这种缺陷病毒去转染原代培养鸭肝细胞，发现与野生株相比，可引起肝细胞内cccDNA的含量增加。这种包膜蛋白抑制cccDNA合成的可能机制为：当包膜蛋白合成增加时，胞质内包含rcDNA的核衣壳可能更多的趋向于与包膜蛋白形成成熟的病毒颗粒释放至细胞外，被逆转运到核内供合成cccDNA的rcDNA相应减少。用接头扫描（linker scanning）和点突变方法进一步研究前S区的p36基因在cccDNA调节中的作用发现，接头置换法使p36基因发生变异后，大多数情况下不影响p36基因的功能，但如果变异发生在第117～136位密码子，则其产生有包膜病毒和调节cccDNA池的能力均有缺陷，使培养上清液中有包膜的病毒显著减少，而细胞内则出现高水平的cccDNA堆积。 综上所述，多数学者认为cccDNA池的含量受表面抗原表达水平的负反馈调节。但是，也有研究认为cccDNA池的形成与表面抗原的合成是相互独立的，表面抗原对细胞内cccDNA的含量并没有调节作用[8]。 Zhang等[9]在DHBV感染鸭的实验中发现cccDNA池含量的大小与感染鸭的鸭龄有关。他们发现以同样剂量的DHBV分别感染3日龄和3周龄的鸭时，感染后24h内两组鸭单个感染肝细胞内的cccDNA含量分别为（6.0±2.4）拷贝和（1.3±0.7）拷贝，差异非常显著。正是细胞内cccDNA池扩增速度的差异，才使病毒在3周龄鸭的水平较低，在肝内扩散速度较慢而容易为宿主的免疫反应所阻断，故只能形成瞬时感染；而3日龄鸭肝细胞内高水平cccDNA的存在则可有助于建立持续感染状态。 二、肝细胞内cccDNA的清除动力学 HBV cccDNA的清除动力学对抗病毒治疗的结局可能有重要影响，是有关cccDNA研究中的另一个重要问题。以慢性HBV感染者为例，如果HBV cccDNA的清除半寿期（half-life）较长，那么意味着需要更长时间的抗病毒药物才有可能使HBV cccDNA被逐渐清除；但另一方面，如果HBV cccDNA的半寿期较短，那么为了维持病毒细胞内cccDNA池的稳定，势必有更多的病毒合成才能去补充细胞核内的cccDNA，这就意味着病毒的复制活动更加频繁，由于病毒逆转录酶缺乏校正功能而导致病毒变异的几率也在增大，对病毒耐药的毒株产生的可能性也大大增加。 1．HBV cccDNA的清除：HBV cccDNA究竟是如何被清除的尚不明确，机体清除cccDNA是否需要摧毁宿主肝细胞亦存争议。有学者认为细胞内cccDNA的清除是基于一种非溶细胞机制，至少在抗病毒治疗过程中cccDNA的下降是如此，但也有学者认为清除细胞内的cccDNA就必需“杀死”肝细胞[10-11]。而关于乙型肝炎的“痊愈”（resolved）是否需要彻底清除cccDNA亦值得进一步探索，因为在HBV急性感染痊愈或抗病毒治疗后HBsAg消失的患者中，肝细胞内仍可有cccDNA存在。 2．HBV cccDNA的半寿期：关于HBV cccDNA池的确切半寿期，现有的资料是相互矛盾的。Civitico和Locarnini[12]在DHBV先天感染的原代培养鸭肝细胞中，测得cccDNA的半寿期平均为3～5d，Delaney等[13]在HBV转染的HepG2细胞中测得cccDNA半寿期为3d。但Addison等[14]在先天感染DHBV的北京鸭中，测得的DHBV cccDNA的半寿期为35～57d。Zhu等[15]在土拨鼠肝炎病毒慢性感染的土拨鼠中测得土拨鼠肝炎病毒cccDNA半寿期33～50d。两组结果相差甚远，可能与使用的实验模型不同有关。 动物模型中进行cccDNA的半寿期测定更有意义，如果测定的结果准确的话，对抗病毒治疗有更大的指导价值。但在活体内进行cccDNA半寿期测定的最大难度在于cccDNA池是不断被细胞内的子代病毒rcDNA补充和更新的。因此，要进行真正意义上的肝组织内cccDNA半寿期测定，必须满足下列两个条件之一：一是胞质内的病毒基因组DNA向细胞核内转位，进而合成cccDNA进程的过程被完全阻止；二是细胞核内cccDNA的起始量和病毒基因组DNA向细胞核内转位的速度是已知的或可以计算得出的。但这两个条件就目前的研究水平而言似很难实现，在上述cccDNA半寿期测定实验中研究者也均未予以充分的证明，因而有关cccDNA半寿期测定的结果其实都是不可靠的。 三、小结与展望 研究HBV cccDNA在肝组织内的扩增和清除动力学的重要意义在于，如何通过cccDNA的动力学研究去找到抑制乃至清除cccDNA的途径，为临床治疗HBV感染提供有益的指导和帮助。HBV cccDNA动力学中一些主要环节到目前为止仍然不清楚，例如rcDNA是如何进入细胞核的、rcDNA进入细胞核后如何转变成cccDNA、cccDNA池扩增的调节机制如何、cccDNA的半寿期究竟有多长、cccDNA是如何被清除的等，这些关键环节的澄清，将可能使慢性乙型肝炎的治疗迈上一个新的台阶。 参 考 文 献 [1]Yang W, Summers J. 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