【关键词】肝炎病毒，乙型； 病毒复制； X蛋白 Regulation of hepatitis B virus replication regulated by HBX protein WANG Jun-zhong, YANG Dong-liang. 【Key words】Hepatitis B virus; Virus replication; X protein 【First author’s address】Division of Clinical Immunology, Tongji Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China Corresponding author: YANG Dong-liang, Email: dlyang@tjh.tjmu.edu.cn 乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）由一段154aa的多肽组成，由HBV的X基因编码，在肝癌的形成中起重要作用，并且广泛参与宿主细胞的基因表达、反式激活和细胞信号传导等[1]。HBx不能直接与DNA结合，但是能活化多种DNA顺式作用元件，如核因子κB、激活蛋白1、 激活蛋白2、CCAAT增强子结合蛋白、活化转录因子/cAMP反应元件结合蛋白等。HBx还能与某些基础转录组件作用，如转录因子ⅡB、转录因子ⅡH、RNA多聚酶的亚基和TATA结合蛋白等。通过这些靶结构，HBx可反式激活多种细胞基因的转录。另外，在细胞质内，HBx还能刺激多种细胞内信号转导通路，包括Ras/Raf丝裂原启动的蛋白激酶、c-Jun激酶、JAK/STAT激酶C等[2]。 一、HBx调节HBV的活跃复制 在转基因小鼠中，X基因缺失突变后病毒的复制水平和持续时间没有明显变化，但是用表达HBx的转基因小鼠和HBV转基因小鼠杂交，其后代病毒复制的水平和持续时间均有明显提高[3]。土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virue，WHV）的基因组和HBV极为相似，Zhang等[4]发现，X基因缺失或突变的WHV活性减弱，感染土拨鼠后只能产生较低水平的病毒血症。Bouchard等[5]将HBx表达缺失的感染性克隆HBV［HBV（-HBx）］转染HepG2细胞后，病毒的复制水平下降了95%。如将HBV（-HBx）和HBx表达质粒共转染，病毒的复制将回复到与野生型相当的水平，而HBx与野生型HBV感染性克隆共转染对病毒的复制没有明显的影响。Keasler等[6]利用小鼠尾静脉高压注射模型证实，小鼠肝脏内HBV的复制75%是HBx依赖性的，25%是HBx非依赖性的。HBx表达缺失时，肝脏内HBV的3种RNA（3.5kb、2.4kb、2.1kb）平均下降72%，核心蛋白的表达也显著下降，而外周血中HBV滴度则下降了99%。在人肝细胞嵌合小鼠中，接种HBx缺失突变的HBV不能产生病毒血症；如果同时接种HBx表达质粒，则能产生高水平的病毒血症[7]，这也证实了HBx是HBV在人肝细胞中活跃复制所必需的。 二、HBx调节HBV复制的机制 HBx在HBV生命周期中起着重要的调节作用，但是HBx调节病毒复制的机制还不清楚，可能的机制包括以下几种。 1．Ca2+-富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（proline-rich tyrosine kinase 2，Pyk2）/局部黏附激酶（focal adhesion kinase，FAK）-Src途径：HBx调节HBV复制是细胞质内钙离子依赖性的。HBx能与线粒体膜上的渗透性转换孔作用，增加细胞质内的Ca2+浓度。在HepG2细胞中，HBx缺失表达时，HBV的复制水平显著下降，用Ca2+激动剂刺激细胞增加细胞质内的Ca2+水平，能使HBV的复制回复到野生型水平。相反，野生型HBV感染性克隆转染HepG2细胞后，同时用线粒体Na+-Ca2+泵抑制剂减少细胞质内Ca2+浓度，野生型HBV的复制水平与HBx表达缺失时相当[5，8-9]。Pyk2和FAK是细胞质内的非受体酪氨酸激酶，在Ca2+的调节作用下发生磷酸化而被激活。Bouchard等[5]发现，HBx通过调节细胞质内Ca2+水平激活Pyk2和FAK，进而促进HBV的复制。在HepG2细胞中，分别用Pyk2抑制剂和突变型的FAK刺激后，野生型HBV的复制下降了15倍以上，和HBx缺失的HBV复制水平相当[5，10]。Pyk2和FAK磷酸化后能与能激活下游的Src激酶，而Src激酶的活化是HBV活跃复制所必需的。研究结果发现，当HBx表达缺失时，Src激酶不能活化，HBV的复制水平也显著下降。用野生型的HBV感染性克隆转染肝癌细胞，并同时阻断Src激酶的活化，其复制水平与HBx缺失突变型相当。另外，HBx还能通过活化Src激酶激活下游的Ras-Raf-丝裂原活化蛋白激酶-c-Jun氨基末端激酶信号通路，调节细胞周期和促进病毒复制[2]。这表明，HBx通过调控细胞质中的Ca2+水平，激活Pyk2/FAK-Src酪氨酸激酶及其下游信号通路，促进HBV的复制。 2．损伤DNA结合蛋白（dameged DNA binding protein，DDB）1结合途径：紫外线损伤DNA结合蛋白由DDB1和DDB2两个亚基构成，其中DDB1与HBx的适当结合是产生病毒感染和复制所必需的。Sitterlin等[11]构建X基因突变的WHV感染性克隆，使HBx与DDB1的结合增强或减弱，将这种突变的WHV DNA注射到土拨鼠肝脏内，不能产生病毒血症或延迟产生较弱的病毒血症。Leupin等[12]构建了一系列突变型的X基因表达载体，其表达的HBx与DDB1的结合有不同程度的降低。用这些HBx表达载体与HBV（-HBx）共转染HepG2细胞，病毒的复制较HBV（-HBx）有所增加，但均不能达到野生型的水平。其中，HBx第96位氨基酸突变时，HBx不能和DDB1结合，与HBV(-HBx)共转染后也不能提高病毒的复制。但是将96位氨基酸突变的HBx和DDB1融合表达，再与HBV（-HBx）共转染，能显著提高病毒的复制水平。另外，DDB1位于细胞核，HBx与DDB1结合并调节HBV的复制也主要发生在细胞核。Leupin等[12]分别在野生型的X基因上添加核定位信号和核排除信号，核定位信号-X与HBV（-HBx）共表达时能使病毒的复制回复到野生型水平，而核排除信号-X与HBV（-HBx）共表达时对病毒的复制没有影响。最近有研究还发现，用RNA干扰技术分别阻断HBx和DDB1的表达均能抑制HBV的复制，同时阻断两者的表达后，HBx的稳定性下降，抑制病毒复制的水平也大大增加[13]。 3．蛋白酶体途径：蛋白酶体是一类存在于细胞内的蛋白水解体系，HBx在细胞内作为一种外来蛋白，是蛋白酶体的作用底物。研究结果发现，HBx能与蛋白酶体的两个亚基XAPC7和XAPC1结合，这种结合可能是HBx发挥功能所必需的，用蛋白酶体抑制剂能阻断HBx的反式激活转录功能，而XAPC7和XAPC1的高表达能使其反式激活转录功能增强。Zhang等[14-15]将WHV（-HBx）和HBV（-HBx）转染HepG2细胞，同时用蛋白酶体特异性的抑制剂处理细胞，能使WHV（-HBx）和HBV（-HBx）的复制恢复到野生型水平，而野生型WHV和HBV复制没有改变，这提示蛋白酶体能调节HBV的复制，并且这种调节是HBx依赖性的。研究结果还发现，HBx与蛋白酶体的两个亚基XAPC7和XAPC1之间的结合具有竞争抑制关系，HBx与XAPC7和XAPC1结合后蛋白酶体降解蛋白的活性显著下降，所以HBx和蛋白酶体调节HBV复制的可能机制是在病毒的组装过程中，HBx与蛋白酶体结合后抑制了蛋白酶体对病毒核衣壳的降解，从而促进病毒的复制和抑制细胞的抗病毒作用。 HBx是HBV活跃复制所必需的，但具体机制还不清楚，HBx是否影响HBV RNAs的生成也存在争议[5，12]，有待进一步研究。 参 考 文 献 [1]Song JW, Lin JS. The role of X protein in the life cycle of hepatitis B virus. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2003, 11: 511-512. (in Chinese) 宋家武,林菊生.X蛋白在乙型肝炎病毒生命周期中作用的研究.中华肝脏病杂志,2003,11:511-512. [2]Bouchard MJ, Schneider RJ. The enigmatic X gene of hepatitis B virus. J Virol, 2004, 78: 12725-12734. [3]Xu Z, Yen TS, Wu L, et al. Enhancement of hepatitis B virus replication by its X protein in transgenic mice. J Virol, 2002, 76: 2579-2584. [4]Zhang Z, Torii N, Hu Z, et al. X-deficient woodchuck hepatitis virus mutants behave like attenuated viruses and induce protective immunity in vivo. J Clin Invest, 2001, 108: 1523-1531. [5]Bouchard MJ, Wang LH, Schneider RJ. Calcium signaling by HBx protein in hepatitis B virus DNA replication. Science, 2001, 294: 2376-2378. [6]Keasler VV, Hodgson AJ, Madden CR, et al. Enhancement of hepatitis B virus replication by the regulatory X protein in vitro and in vivo. J Virol, 2007, 81: 2656-2662. [7]Tsuge M, Hiraga N, Imamura M, et al. HBx protein is necessary for HBV replication in human hepatocytes. Hepatology, 2008, 48(suppl): 671 [8]Bouchard MJ, Puro RJ, Wang L, et al. Activation and inhibition of cellular calcium and tyrosine kinase signaling pathways identify targets of the HBx protein involved in hepatitis B virus replication. J Virol, 2003, 77: 7713-7719. [9]McClain SL, Clippinger AJ, Lizzano R, et al. Hepatitis B virus replication is associated with an HBx-dependent mitochondrion-regulated increase in cytosolic calcium levels. J Virol, 2007, 81: 12061-12065. [10]Bouchard MJ, Wang L, Schneider RJ. Activation of focal adhesion kinase by hepatitis B virus HBx protein: multiple functions in viral replication. J Virol, 2006, 80: 4406-4414. [11]Sitterlin D, Bergametti F, Tiollais P, et al. Correct binding of viral X protein to UVDDB-p127 cellular protein is critical for efficient infection by hepatitis B viruses. Oncogene, 2000, 19: 4427-4431. [12]Leupin O, Bontron S, Schaeffer C, et al. Hepatitis B virus X protein stimulates viral genome replication via a DDB1-dependent pathway distinct from that leading to cell death. J Virol, 2005, 79: 4238-4245. [13]Tang KF, Xie J, Chen M, et al. Knockdown of damage-specific DNA binding protein 1 (DDB1) enhances the HBx-siRNA-mediated inhibition of HBV replication. Biologicals, 2008, 36: 177-183. [14]Zhang Z, Torii N, Furusaka A, et al. Structural and functional characterization of interaction between hepatitis B virus X protein and the proteasome complex. J Biol Chem, 2000, 275: 15157-15165. [15]Zhang Z, Protzer U, Hu Z, et al. Inhibition of cellular proteasome activities enhances hepadnavirus replication in an HBX-dependent manner. J Virol, 2004, 78: 4566-4572.
中华肝脏病杂志版权 多动症 |