中国乙型肝炎病毒B、C基因型参照序列的建立

【摘要】  目的  建立中国HBV B、C基因型参照序列。 方法  从GenBank中获得来源于中国不同地区的HBV全基因序列，通过基因分型和序列比对，以相同位置频率最高碱基作为参照碱基建立序列；将这些参照序列与国内外的参照序列进行比较，了解其中的不同点；对不同编码区的氨基酸序列进行比较。对B、C基因型HBV的碱基替代情况进行统计学分析，其中1762、1764、1896位点采用χ2检验，1858位点采用Fisher’s确切概率法检验。 结果  获得了中国HBV B、C基因型参照序列。 Bc与Ba、Bj基因型HBV的全基因序列同源性分别为99.32%、95.52%，S基因序列同源性分别为99.71%、98.68%；Cc与C、Caus基因型的全基因序列同源性分别为98.44%、93.97%，S基因序列同源性分别为99.27%、95.01%。与Bj型相比，Bc和Ba型同源性更高；与Caus型相比，Cc和C型同源性更高。不同编码区的氨基酸序列也有差异；两种基因型在1762、1764、1858位点的碱基分布差异均有统计学意义（P值均<0.05）。 结论  建立的HBV B、C基因型参照序列可以作为中国HBV参照序列，为设计引物和分析碱基或（和）氨基酸变异提供参考。

【关键词】  肝炎病毒，乙型； 基因型； 变异； 参照序列

Establishment of reference sequences of hepatitis B virus genotype B and C in China    ZHANG Zhen-hua*, ZHANG Ling, LU Meng-ji, YANG Dong-liang, LI Xu. *Department of Infectious Diseases, the First Affiliated Hospital, Anhui Medical University, Hefei 230022, China

Email: zzh1974cn@ yahoo.com.cn

【Abstract】    Objective    To establish the reference sequences of genotype B and C of hepatitis B virus in China. Methods    Genome sequences of Hepatitis B virus isolated from different area in China were retrieaved from GenBank. These genome sequences were alignmented and the most common sequences were regarded as reference sequences. The amino acid sequences were also alignmented. Results    The homology was 99.32% between Bc genome and Ba genome, and it was 95.52% between Bc genome and Bj genome. The S gene sequence homology was 99.71% between Bc and Ba, and it was 98.68% between Bc and Bj. The homology was 98.44% between Cc genome and C genome, and it was 93.97% between Cc genome and Caus genome. The S gene sequence homology was 99.27% between Cc and C, and it was 95.01% between Cc and Caus. There was significant difference at the sites of 1762, 1764, 1858 between genotype B and genotype C (P < 0.05). The amino acid sequences were also different between genotype B and genotype C.  Conclusion    Bc and Cc sequences of Hepatitis B virus can be regarded as the reference sequences of genotype B and C.

【Key words】     Hepatitis B virus;    Genotype;    Variation;    Reference sequence

根据HBV全基因组序列差别＞8%将HBV分为8个基因型，分别命名为A～H[1-2]。根据S基因的差别＞4%可将HBV基因型分为20个亚型[3]。HBV的基因型和亚型有不同的地理分布[1-2，4-5]。中国南方的HBV流行株为B、C型，北方为C型，两种基因型合计约为95%[6]，此外还有少量A、D等基因型。国际上已经存在不同基因型的参照序列以及以此为依据建立了多种基因型检测方法[7-11]；但这些参照株多为单一患者来源，本身就存在多种碱基替代情况，且不同地区的相同基因型或亚型间还有较大差异，需要建立适合中国的B、C基因型参照序列。郭亚兵等[12]对7例HBV B、C基因型序列进行比对分析建立了中国参照株，但分析的碱基序列来源与数量有限，没有区分B、C基因型。我们通过GenBank获得来源于中国不同地区的B、C型全基因序列共95株，通过对比分析建立中国HBV B、C基因型参照株Bc和Cc，利于进行基因序列比对，了解各个位点的基因变异情况；同时为引物设计提供合适的模板，减少由于引物设计偏差而导致的假阴性结果。

材料与方法

1. 材料：从GenBank获得来源于中国不同地区的HBV全基因序列，为使所选序列更具有代表性，尽量减少同一作者提供的基因序列，一般不超过5个。其中B基因型序列号为：AF100308、AF100309、AF282917、AF282918、AF461360、AF479684、AY163869、AY163870、AY167089、AY167093、AY167097、AY167098、AY167102、AY206373、AY206375、AY206383、AY206390、AY206391、AY217355、AY217356、AY217357、AY220697、AY220698、AY220703、AY220704、AY518556、AY766463、AY800389、AY800391、AY800392、AY817509、DQ377158、DQ448619、DQ448620、DQ448621、DQ448622、DQ448623、DQ904357、DQ975271、DQ980548、DQ995801、DQ995802，共42株，主要是B1和B2亚型。C基因型序列号为：AB205123、AF182802、AF182804、AF182805、AF411408、AF411409、AF411410、AF411411、AF411412、AF458664、AF458665、AF461361、AF533983、AY040627、AY066028、AY123424、AY167092、AY167095、AY167096、AY167099、AY206386、AY206392、AY217376、AY306136、AY862869、DQ089800、DQ089801、DQ089802、DQ089803、DQ089804、DQ246215、DQ377165、DQ478897、DQ478898、DQ478899、EF688062、Y18856、Y18857、DQ478901、DQ922649、DQ922650、DQ922651、DQ975272、DQ975273、DQ975274、DQ980547、DQ980549、DQ980551、DQ986375、DQ986376、DQ993181、EF536065、EF536066，共53株，主要是C1和C2亚型。

2. 建立参照序列：对所获HBV全基因序列进行基因型分类，其中B基因型42株，C基因型53株。用美国Premier生物软件公司的Primer7.0软件对这些序列进行同源性分析，每个核苷酸位置以最高频率碱基作为参照碱基，获得最终的基因型参照序列。

3. 碱基替代情况分析：引物设计和同源性分析尤其需要注意替代碱基频率较高的位点，在获得中国HBV B基因型和C基因型参照序列后，分析替代碱基＞20%位点的碱基构成情况。

4. 与其他基因型进行比较：用Primer7.0软件将参照株Bc、Cc和国际上其他参照株[7-15]进行核苷酸和氨基酸序列比较和分析，其中分为全基因序列比较和S基因序列比较。

5. 建立结构区氨基酸参照序列：对参照序列4个结构区的核苷酸序列和氨基酸序列与国际上其他参照株进行比较，了解不同参照株的不同结构区之间的差异。

6. 部分重要位点的核苷酸替代情况分析：采用SPSS13.0软件对B、C基因型在1762、1764、1814、1858、1896位点的碱基替代情况进行统计学分析，其中1762、1764、1896位点采用χ2检验，1858位点采用Fisher’s确切概率法检验。

结    果

1． 参照株的建立：通过比对分析获得中国的HBV B基因型参照株Bc和C基因型参照株Cc（图1）。与参照序列相比，B基因型序列的全基因同源性为98.35%，在去除缺失突变株后S区核苷酸同源性为99.29%，氨基酸同源性为98.66%；C基因型序列的全基因同源性为97.85%，在去除缺失突变株后S区核苷酸同源性为98.92%，氨基酸同源性为98.11%。

2． 碱基替代情况分析：不同区域碱基替代率有明显差异，部分位点碱基替代较多，在进行序列比对和引物设计时应当特别注意。对替代碱基≥20%位点分布情况进行统计分析，发现各区均有高变异率位点，而且C基因型更加常见（表1），对上述位点进行引物设计、变异检测、功能分析等时必须考虑到核苷酸差异的可能影响（表1）。

3． 与不同基因型碱基序列的比较：比较不同基因型的全长基因序列和S基因序列，结果显示（表2）：Bc与Ba、Bj基因型的全基因序列同源性分别为99.32%、95.52%，S基因序列同源性分别为99.71%、98.68%，提示Bc基因型与Ba基因型同源性更高。Cc与C、Caus基因型的全基因序列同源性分别为98.44%、93.97%，S基因序列同源性分别为99.27%、95.01%，提示Cc基因型与C基因型同源性更高。与其他基因型的全长基因序列差异均＞8%，S基因序列差异均＞4%。

4． 结构区氨基酸参照序列比较：对B、C基因型的多个编码区核苷酸序列以及氨基酸序列进行同源性比较，与Bj型相比，Bc和Ba型同源性更高；与Caus型相比，Cc和C型同源性更高（表3，4）。

5． 部分重要位点的核苷酸替代情况：HBV的部分核苷酸位点发生变异可对复制、表达等产生重要影响，对所有比对碱基进行核苷酸变异位点分析发现，两种基因型在1762、1764位点均有明显差异（χ2＝4.130，P＝0.042；χ2＝5.808，P＝0.016），1858位点也有明显差异（P值均<0.05），但是1896位点的差异无统计学意义（表5）。

讨    论

慢性乙型肝炎患者的HBV每位点每年的天然进化率为1.4×105～3.2×105。但在肝移植中，这种替代率增加100倍。突变有一定的倾向性，尤其是基本核心启动子区、前C区、P区和S区的“a”决定簇[13]。根据基因的变异情况，可以区分HBV的基因型和突变。HBV基因型体现了病毒的稳定性，它是长期在数量压力下所随机改变形成的。亚基因型是HBV基因型的一个亚组，核苷酸的差别为4%～8%。有人将基因亚型进一步区分为不同的分化单元，其核酸差别<4%[14-16]。HBV不同基因型有不同的基因长度。在药物或者天然免疫压力下，个体的突变率增加，主要包括疫苗、抗病毒治疗、乙型肝炎免疫球蛋白治疗时的逃避突变。

中国的HBV感染者多为B、C基因型，但是核苷酸、氨基酸序列与国际上B、C基因型参照株有一定差异，影响我们进行HBV的相关研究，迫切需要建立我们国家流行HBV的参照株，有利于进行引物设计、流行病学调查、变异检测、功能分析和药物疗效评价等。通过对来源于中国不同地方的HBV全基因序列进行比对分析，建立中国的B、C基因型参照株Bc和Cc，由于所使用的序列数量较大，地域分布广，能够代表中国HBV的序列特点，具有较好的可靠性和实用性。

通过比较分析发现部分位点的核苷酸序列差异较大，容易出现核苷酸变异，因而在进行引物设计时需要注意避免这些区域或者进行碱基兼并，否则容易出现假阴性结果。通过建立中国HBV参照株，可以为HBV研究提供相对可靠的参照，避免因为标准不一致所产生的种种问题。在进行序列比对基因变异分析时，常由于参照不同，得到的结果有差异，难以得到公认，给研究结果的评判造成困难，而建立与当地流行株一致的参照株就可以较好地解决这个问题。同时随着碱基合成技术的进步，可以按照参照株合成完整的HBV感染性质粒或者各种HBV片段，为HBV的分子生物学和免疫学研究提供合适的参照标准。在设计HBV引物时，可以根据碱基变异情况避开高度变异区并在不同位点合理选择碱基兼并，从而大大提高HBV PCR扩增的特异度和灵敏度，以及实验的成功率。

由于不同地区的HBV存在基因型差异，各地区的HBV参照株也有所区别，而且不同感染者的HBV序列存在差异，慢性HBV感染者体内HBV也存在准种现象，因此，建立中国的HBV基因型参照株，按照碱基替代情况对变异较大位点以及重要位点进行标示，可为引物设计和变异研究提供参照。

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