外源性尿激酶抗肝纤维化的作用机制

【摘要】  目的  探讨外源性尿激酶抗大鼠肝纤维化的作用机制。 方法  采用复合致病因子复制肝纤维化大鼠模型。大鼠随机分为对照组（正常饮食）、肝纤维化组（复合致病因子饲养6周）和尿激酶预防组（复合致病因子+尿激酶饲养6周）。检测并比较各组大鼠血透明质酸含量、肝组织内羟脯氨酸、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）、尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）、尿激酶型纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）、转化生长因子β1（TGFβ1）、Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达量以及PAI-1 mRNA和TGFβ1 mRNA的相对表达量。多组间用单因素方差分析q检验，两组间比较采用t检验，多组间等级资料比较采用Kruskal Wallis H检验，多样本间两两比较采用扩展的t检验。 结果  血浆ALT、AST、总胆红素、透明质酸和肝组织内羟脯氨酸含量在尿激酶预防组大鼠分别为（46.66±6.30）U/L、（126.26±31.65）U/L、（31.11±4.20）μmol/L、（109.70±18.81）μg/L和（0.98±0.09）mg/g，较肝纤维化组的（101.57±11.97）U/L、（205.89±56.26）U/L、（67.75±2.75）μmol/L、（184.43±32.36）μg/L和（1.65±0.16）mg/g均明显降低（q值分别为3.3801～20.0061，P值均＜0.01）。尿激酶预防组α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、TIMP-1、PAI-1及TGFβ1蛋白相对表达量分别为299.27±37.36、210.05±27.17、192.94±24.48、213.70±32.21、204.25±17.92和205.97±23.81，较肝纤维化组的418.83±30.21、323.77±21.53、302.37±31.43、376.63±25.19、313.53±26.67和327.42±36.75均明显减少，而uPA蛋白表达增加。尿激酶预防组PAI-1 mRNA、TGFβ1 mRNA表达减少，肝纤维化程度明显减轻。 结论  预防性使用外源性尿激酶可减轻肝损伤，降低血浆转氨酶、胆红素，减少肝星状细胞活化，降低TIMP-1、PAI-1蛋白表达，增加uPA蛋白表达，加速组织损伤修复，延缓肝纤维化的发生。

【关键词】  尿纤溶酶原激活物； 金属蛋白酶1组织抑制剂； 转化生长因子β； 肝硬化

The effect of urokinase on hepatic fibrogenesis in rats   WU Xi-run*, WANG Qi, WANG Ling, SHI Shui-sheng, GUO Wen-dong. *Department of Gastroenterology, the Second Medical College, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

Email: xirunwu66@ yahoo.com.cn

【Abstract】    Objective    To investigate the effect of urokinase on hepatic fibrogenesis in rats. Methods   Hepatic fibrosis was induced in rats by complex pathogenic factors including subcutaneous injections of carbon tetrachloride, alcohol and cholesterol feeding. Animals were randomly divided into 3 groups: normal control group, hepatic fibrosis group (complex pathogenic factors for 6 weeks), UK prevention group (complex pathogenic factors+UK for 6 weeks). The animals were sacrificed at the end of week 6. The expression of α-SMA,  uPA, PAI-1, TGFβ1,  TIMP-1, collagen type I and type III proteins in hepatic fibrosis tissue was detected by immunohistochemistry, the expression of PAI-1 and TGFβ1 mRNA in the hepatic fibrosis tissue was quantified by real time RT-PCR. The serum levels of hyaluronicacid (HA), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), bilirubin (TBil) and the content of liver hydroxyproline (Hyp) were detected using ELISA kits. Results    The serum ALT, AST, TBil, HA and the content of liver Hyp were (46.66±6.30) U/L, (126.26±31.65) U/L, (31.11±4.20)μmol/L, (109.70±18.81)μg/L and (0.98±0.09) mg/(g liver), respectively, in UK prevention group, which were significantly lower than those [ (101.57±11.97) U/L, (205.89±56.26) U/L, (67.75±2.75)μmol/L, (184.43±32.36)μg/L and (1.65±0.16) mg/(g liver), respectively] in hepatic fibrosis group (q = 3.3801-20.0061, P < 0.01). The levels of α-SMA, collagen type I, type III, TIMP-1, PAI-1, TGFβ1 proteins were (299.27±37.36), (210.05±27.17), (192.94±24.48), (213.70±32.21), (204.25±17.92), (205.97±23.81), respectively, in UK prevention group,  which were significantly lower than those [ (418.83±30.21), (323.77±21.53), (302.37±31.43), (376.63±25.19), (313.53±26.67) and (327.42±36.75), respectively] in hepatic fibrosis group. The level of uPA protein was increased, and the expression of PAI-1, TGFβ1 mRNA in hepatic fibrosis tissue was decreased in UK prevention group. Conclusion    In the early stage of hepatic fibrogenesis, urokinase can attenuate the  progression of rat hepatic fibrosis via upregulation of uPA, downregulation of TGFβ1, and inhibition of HSC activation.

【Key words】     Urokinase plasminogen activator;    Tissue-inhibitor of metalloproteinase-1;    Transforming growth factor beta;    Liver cirrhhosis

肝纤维化、肝硬化的发生是细胞外基质（ECM）合成和降解失衡的结果。本研究应用外源性尿激酶（urokinase）预防性处理肝纤维化大鼠，观察处理后大鼠肝组织中α-平滑肌肌动蛋白（α- smooth muscle actin，α-SMA）、金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）、尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase plasminogen activator，uPA）、纤溶酶原激活物抑制因子-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）、转化生长因子β1（TGFβ1）、Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的表达及肝组织中PAI-1 mRNA和TGFβ1 mRNA的变化，为临床治疗肝硬化、促进纤维蛋白溶解、逆转肝纤维化提供理论依据。

材料与方法

1．动物模型的复制及分组：雄性Wistar大鼠25只，清洁级，购自山西医科大学动物实验中心，体质量240～270g，随机分为正常对照组（6只）、肝纤维化组（9只）及尿激酶预防组（10只）。采用复合致病因子复制肝纤维化动物模型：体积分数40% CCl4（购自宜兴市第二化学试剂厂）每100g体质量皮下注射0.3ml，每隔3d 1次，0.5%高胆固醇、30%乙醇喂养，共6周。CCl4首次加倍，最初2周予20%的高脂饮食（80%玉米面+20%猪油）。尿激酶预防组皮下注射CCl4前皮下注射尿激酶（国药准字H3702203，购自山东绿叶制药公司）1200U/100g体质量，每隔3d 1次，共6周。

2．实验方法：动物于6周末乙醚麻醉后，腹主动脉取血并取肝左叶组织分别测定：（1）血浆AST、ALT（赖氏法）以及总胆红素（固兰B法）；（2）肝组织学改变：取肝组织以4%甲醛溶液固定，HE染色，VG染色，依据肝组织学改变进行肝纤维化分为正常、Ⅰ～Ⅵ级[1]；（3）肝组织羟脯氨酸（Hyp）测定：改进氯胺T法；（4）肝组织α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型胶原以及uPA、PAI-1、TGFβ1、TIMP-1蛋白质表达（免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司）：肝组织中性甲醛溶液固定，SABC法，DAB显色，苏木素复染，结果用图像分析仪测定，用积分吸光度作定量分析；（5）肝组织PAI-1 mRNA和TGFβ1 mRNA变化：新鲜肝组织提取总RNA，RT-PCR法检测。按照美国Gibco公司的Trizol试剂盒说明书行总RNA的提取，测A260/A280在1.8～2.0之间。PAI-1上、下游引物序列分别为5′-ATGAGATCAGTACTGCGGACGCCATCTT TG-3′和5′-GCACGGAGATGGTGCTACCATCA GACTTGT-3′；TGFβ1上、下游引物序列分别为：5′-CGGGGCGACCTGGGCACCATCCATGAC-3′和5′-CTGCTCCACCTTGGGCTTGCGACCCAC-3′；β-肌动蛋白（β-actin）上、下游引物序列分别为：5′-GATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGA-3′和5′-GCTCATTGCCGATAGTGATGACCT-3′。各取2μg总RNA进行逆转录（5×缓冲液10μl，Rnasin 0.5μl，AMV 反转录酶1μl，随机引物1μl，dEPC H2O 19.5μl），42℃水浴1h，95℃加热10min后终止反应。取10μl反转录产物作为PCR模板进行扩增，反应体系含10×缓冲液5μl，2.5mmol/L MgCl2 3μl，2.5mmol/L dNTP 4μl，0.5pmol/μl上、下游引物各1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加H2O 25.5μl，总体积50μl。94℃变性1min，60℃（72℃）退火1min，72℃延伸5～7min，28～30个循环，产物大小分别为333、406、630bp。各取10μl PCR反应产物，经15g/L琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后在紫外灯下用凝胶成像系统分析，以β-actin为内参照，计算每一样本的PAI-1/β-actin和TGFβ1/β-actin PCR扩增产物的相对比值。

3. 统计学处理：计量资料用均数±标准差表示，多组间采用单因素方差分析q检验，两组间比较采用t检验，多组间等级资料比较采用Kruskal Wallis H检验，多样本间两两比较采用扩展的t检验，P< 0.05为差异有统计学意义。

结    果

1．动物一般状况与动物死亡情况：给药4周后肝纤维化组动物一般状况较差，表现为精神不振、活动减少、尿黄、体质量下降、消瘦，整个实验过程中动物共死亡3只。尿激酶预防组动物一般状况较好，体质量下降不明显，未见明显消瘦，实验过程中动物死亡2只。

2．尿激酶对肝纤维化分级的影响：肝纤维化组肝组织学改变表现为肝纤维化Ⅲ级、Ⅳ级，而尿激酶预防组主要表现为肝纤维化Ⅰ级、Ⅱ级，两组差异有统计学意义（H＝15.675，P＜0.05），见表1（略）。

3. 尿激酶对肝损伤及羟脯氨酸、透明质酸的影响：尿激酶预防组动物血浆AST、ALT、总胆红素、羟脯氨酸及透明质酸均低于肝纤维化组（q值为3.3801～20.0061，P值均＜0.01），见表2。

4．尿激酶对Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白质表达的影响：在正常肝组织，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白在肝窦、中央静脉周围和汇管区可见较弱表达。在肝纤维化组，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白表达明显增加。在尿激酶预防组，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白表达下降（表3，略）。

5．尿激酶对α-SMA、TIMP-1、TGFβ1及uPA、PAI-1蛋白质表达的影响：在正常肝组织，α-SMA表达仅分布于血管壁，TGFβ1仅见在Disse腔弱表达，TIMP-1、uPA、PAI-1未见阳性表达。而在肝纤维化组，肝纤维化时可见有α-SMA大量表达，TGFβ1、TIMP-1、PAI-1表达明显增加，uPA表达仅轻微增加。在尿激酶预防组α-SMA、TIMP-1、TGFβ1、PAI-1蛋白表达较肝纤维化组均明显下降，uPA表达增加（表4，图1～4）。

6．尿激酶对肝组织PAI-1 mRNA和TGFβ1 mRNA表达的影响：尿激酶预防组TGFβ1 mRNA表达减少，而PAI-1 mRNA表达在肝硬化组与尿激酶预防组差异无统计学意义（表5，图5）。

讨    论

肝纤维化是病毒、毒物等导致的肝脏反复损伤以及损伤后反复修复的过程，即肝纤维化是一种创伤愈合的过程，包括炎症，胶原、非胶原细胞外基质的合成和组织重建，由于基质合成和基质降解失衡最终导致肝纤维化、肝硬化的发生。预防治疗甚或逆转肝纤维化在于：除去损伤因素；抑制肝星状细胞活化，减少胶原纤维的产生；增加ECM的降解，抑制减少基质降解的因素，其中促进ECM降解越来越受到人们的关注。ECM降解酶系主要有:脯肽酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、糖苷酶、天门酰氨蛋白酶和基质金属蛋白酶（MMPs）。其中MMPs包括胶原酶、间充质溶解素和明胶酶，它们对ECM有广泛的降解作用,是调节ECM动态平衡最重要的一大酶系。uPA属丝氨酸蛋白酶类，除激活纤溶酶原转变为纤溶酶、激活MMPs、介导细胞周围基质降解外，可作用于生理、病理条件下的细胞迁移和组织修复，直接降解细胞外基质及基底膜，促进肝损伤后基质重建、促进肝硬化纤维降解。所有MMPs均以无活性的潜酶形式分泌，血浆纤溶酶和间充质溶解素是已知的生理性激活因子，因此丝氨酸蛋白酶在MMPs激活中起决定性作用。体外研究表明，通过重组腺病毒载体将人尿激酶型纤溶酶原激活剂基因（AdHuPA）导入肝星状细胞内可维持uPA高效表达，抑制ECM沉积[2-3]。有研究者将AdHuPA注入肝纤维化或肝硬化动物体内，发现uPA表达增加，MMP-3、MMP-9、MMP-2表达上调，TIMP-1、PAI-1基因表达下调，肝纤维化程度减轻[4-5]。Salas等[6]将Genistein用于肝纤维化动物，发现uPA表达增加，肝星状细胞表达减少，提出Genistein具有抗肝纤维化作用。也有研究结果表明，在肝硬化患者血清及肝组织中，PAI-1表达增加，uPA/PAI-1失衡，提出减少PAI-1蛋白表达，有可能加速组织损伤修复，减缓肝纤维化的发生[7-8]。

采用复合致病因子复制肝纤维化动物模型，通过外源性尿激酶干预，结果表明，在肝纤维化发生发展过程中，肝纤维化组动物血浆AST、ALT、总胆红素逐渐升高，血透明质酸、肝组织内Hyp含量增加，α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型胶原以及TIMP-1、TGFβ1蛋白表达明显增加；尿激酶肝纤维化预防组AST、ALT、TBil均明显降低，血透明质酸、肝组织内Hyp含量明显下降，α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型胶原以及TIMP-1、TGFβ1蛋白表达明显减少，uPA蛋白表达增加，肝星状细胞活化减少，TGFβ1 mRNA表达减少，肝纤维化程度明显减轻。因此，早期预防使用尿激酶可减轻肝损伤，减少肝星状细胞活化，减少TIMP-1、PAI-1蛋白表达，增加uPA蛋白表达，降低TGFβ1 mRNA表达，加速组织损伤修复，减缓肝纤维化的发生和发展。

参  考  文  献

[1]Yang CQ, Hu GL, Zhou WH, et al. Effects of colchicine on the expression of matrix metalloproteinase-1 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in the livers of rats with hepatic fibrosis. Zhonghua Chuanranbing Zazhi, 2000, 18: 176-179. (in Chinese).

杨长青,胡国龄,周文红,等.秋水仙碱对肝纤维化大鼠肝脏基质金属蛋白酶-1及其抑制因子-1表达的影响.中华传染病杂志,2000,18:176-179.

[2]Lin Y, Chen WZ, Xie WF, et al. Effect of exogenous human urokinase-type plaminogen activator gene on the production of collagens in hepatic stellate cells. Zhonghua Xiaohua Zazhi, 2004, 24: 387-390. (in Chinese)

林勇,陈伟忠,谢渭芬,等.导入外源人尿激酶型纤溶酶原激活剂基因对肝星状细胞胶原沉积的影响.中华消化杂志,2004,24:387-390.

[3]Gonz醠ez-Cuevas J, Bueno-Topete M, Armendariz-Borunda J. Urokinase plasminogen activator stimulates function of active forms of stromelysin and gelatinases (MMP-2 and MMP-9) in cirrhotic tissue. J Gastroenterol Hepatol, 2006, 21: 1544-1554.

[4]Lin Y, Xie WF, Chen YX, et al. Treatment of experimental hepatic fibrosis by combinational delivery of urokinase-type plasminogen activator and hepatocyte growth factor genes. Liver Int, 2005, 25: 796-807.

[5]Miranda-D韆z A, Rinc髇 AR, Salgado S, et al. Improved effects of viral gene delivery of human uPA plus biliodigestive anastomosis induce recovery from experimental biliary cirrhosis. Mol Ther, 2004, 9: 30-37.

[6]Salas AL, Montezuma TD, Fari馻 GG, et al. Genistein modifies liver fibrosis and improves liver function by inducing uPA expression and proteolytic activity in CCl4-treated rats. Pharmacology, 2008, 81: 41-49.

[7]Wu XR, Wang Q, Shi SS, et al. The plasma levels of urokinase plasminogen activator and urokinase plasminogen activator receptor and plasminogen activator inhibitor-1 in patients with different stages of liver cirrhosis following chronic hepatitis B. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2004, 12: 82-84. (in Chinese).

武希润,王琦,师水生,等.肝硬化患者血浆中尿激酶型纤溶酶激活物的检测及其意义.中华肝脏病杂志,2004,12:82-84.

[8]Wu XR, L  MH, Wang Q, et al. The plasma levels of transforming growth factor β1 and the protein expressions of α-SMA, urokinase plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor-1 in liver of patients with different grades of hepatic fibrosis. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2004, 12: 400-402.(in Chinese).

武希润,吕敏和,王琦,等.α-平滑肌肌动蛋白表达及血浆转化生长因子β1变化在肝纤维化发生发展中的作用.中华肝脏病杂志,2004,12:400-402.

中华肝脏病杂志版权