【摘要】 目的 探讨白细胞介素10（IL-10）基因修饰骨髓源性肝干细胞（BDLSC）移植对大鼠纤维化肝脏的炎症反应和肝再生的影响。 方法 雌性Wistar大鼠50只随机分为4组：（1）正常组（10只）：皮下注射橄榄油3ml/kg，2次/周，首剂加倍，共注射8周；（2）模型组（16只）：皮下注射体积分数40% CCl4和橄榄油（CCl4∶橄榄油＝2∶3），3 ml/kg，注射次数和时间同正常组，于第4 周末经门静脉分支输注1ml无菌等渗盐水（NS）；（3）BDLSC组（12只）：造模方法同模型组，于第4周末经门静脉分支输注BDLSC 1ml（每毫升NS含BDLSC 2×105个），后续处理同模型组；（4）BDLSC/IL-10组（12只）：造模方法同模型组，于第4周末经门静脉分支输注IL-10基因修饰BDLSC 1ml（每毫升NS含BDLSC 2×105个），后续处理同模型组。大鼠于造模第8 周末处死，留取肝组织备用。采用酶联免疫吸附法检测肝组织IL-10、肿瘤坏死因子α含量；采用苏木素-伊红染色法观察肝组织病理学改变情况；分别采用实时定量PCR法和免疫组织化学法检测肝组织肝细胞生长因子mRNA和增殖细胞核抗原蛋白的表达。根据不同资料采用方差分析或Kruskal-Wallis检验进行统计学分析。 结果 BDLSC能顺利种植于肝内，并至少维持4周。大鼠肝组织的IL-10/TNFα比值，模型组为0.05±0.01，正常组为0.26± 0.04（F＝57.538，P<0.01），BDLSC/IL-10组为0.68±0.21，BDLSC组为0.08±0.03，模型组比正常组明显降低, BDLSC/IL-10组比正常组明显升高。单纯BDLSC移植未能改善IL-10/TNFα比值降低情况。模型组大鼠肝组织病理学改变明显，炎症反应重，BDLSC组炎症有所减轻，BDLSC/IL-10组的肝组织形态接近正常组。模型组大鼠肝组织的肝细胞生长因子mRNA和增殖细胞核抗原蛋白表达增强，分别为0.0049±0.0009和8511.80±4560.34，F值分别为84.945和82.376，P值均<0.01。BDLSC组二者表达进一步增强，分别为0.0145±0.0022和15785.21±6431.66，F值分别为84.945和82.376，P值均<0.01，BDLSC/IL-10组较BDLSC组增强更明显，分别为0.0684±0.0190和44371.43±13865.65，F值分别为84.945和82.376，P值均<0.01，差异有统计学意义。 结论 IL-10基因修饰BDLSC移植能减轻纤维化肝脏的炎症反应，促进肝再生，为有效治疗肝纤维化提供了依据。 【关键词】 肝硬化； 大鼠; 白细胞介素10； 细胞移植; 治疗； 骨髓源性肝干细胞 Effect of interleukin 10 gene-modified bone marrow-derived liver stem cells transplantation on hepatic inflammatory response and liver regeneration in hepatic fibrosis rats LAN Ling*, CHEN Yuan-wen, SUN Chao, LIU Bo-wei, SUN Qiao-ling, LI Ding-guo. *Digestive Department, the People抯 Hospital of Henan Province, Zhengzhou 450003, China Corresponding author: LI Ding-guo, Email: dingguo.li@ hotmail.com. Digestive Department, Xinhua Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200092, China 【Abstract】 Objective To explore effect of interleukin 10 (IL-10) gene-modified bone marrow-derived liver stem cells (BDLSCs) transplantation on hepatic inflammatory response and liver regeneration in rats with liver fibrosis. Methods 50 female Wistar rats were randomly devided into 4 groups: (1) control group: 10 rats were subcutaneously injected with olive oil for 8 weeks; (2) fibrosis groups: 16 rats were subcutaneously injected with carbon tetrachloride (CCl4) for 8 weeks to induce liver fibrosis; (3) BDLSC group: 12 rats were subcutaneously injected with CCl4 for 8 weeks, and were transplanted with 2×105 BDLSC at week 4; (4) BDLSC/IL-10 group: 12 rats were subcutaneously injected with CCl4 for 8 weeks, and were transplanted with 2×105 IL-10 gene-modified BDLSC at week 4. IL-10 and tumor necrosis factor alpha (TNFα) in liver tissues were detected by ELISA. HE stained liver tissues were observed under light microscope. The expression of hepatocyte growth factor (HGF) was quantified by real-time RT-PCR, and the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was determined by immunohistochemistry. Results The ratio of IL-10/TNFα in fibrosis group (0.05±0.01) was lower than that in control group (0.26±0.04) (P < 0.01). Transplantation of untreated BDLSCs did not improve the ratio (P > 0.05), however, transplantation of IL-10 modified BDLSCs improved the ratio significantly (P < 0.01). Severe inflammatory response and fibrosis were observed in fibrosis group. Inflammatory response was alleviated to some extent in the BDLSC group, and the histopathology of BDLSC/IL-10 group was not significantly different from that of the control group. Compared to the control group, the expression of HGF mRNA and PCNA protein was increased in the fibrosis group (P < 0.01). The expression of HGF and PCNA was further increased by BDLSCs or IL-10 modified BDLSCs transplantation. Compared to BDLSCs, IL-10 gene-modified BDLSCs were more potent to induce the expression of HGF and PCNA. Conclusion Transplantation of IL-10 gene-modified BDLSCs can alleviate hepatic inflammatory response and promote liver regeneration in hepatic fibrosis rats. 【Key words】 Liver cirrhosis; Rats; Interleukin-10; Cell transplantation; Therapy; Bone marrow-derived liver stem cells 骨髓干细胞（bone marrow stem cell，BMSC）移植已被应用于实验性肝纤维化治疗，但疗效差异较大[1-3]。BMSC移植有一定的特殊性和局限性：一是BMSC输注所致的血流干扰会造成持续局部缺血—再灌注损伤，导致局部炎症反应，加重病情进展[4]；二是肝纤维化的迁延病程导致纤维间隔形成、肝窦状隙变窄、血流交换的障碍和生长空间的狭小可能阻碍BMSC的肝内增殖以及内源性肝再生[5]。我们前期研究结果已证实，β2m-/Thy-1+骨髓源性肝干细胞（bone marrow-derived liver stem cell，BDLSC）是BMSC中的特殊肝干细胞亚群[6]，而调节炎症反应的抗纤维化因子白细胞介素10（IL-10）基因能在体外成功诱导BDLSC高水平分泌IL-10至细胞外[7]。我们设想将IL-10基因修饰的BDLSC移植入肝纤维化大鼠肝内，以期利用基因和干细胞联合移植达到减轻肝脏炎症反应、促进肝再生的目的，为今后对IL-10基因修饰BDLSC移植治疗肝纤维化的疗效评价提供理论依据和实践基础。 材料与方法 1. 主要材料和试剂：携带IL-10基因的腺病毒载体由上海交通大学医学院附属新华医院消化实验室构建；DMEM/F12培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司；免疫磁珠荧光分选试剂盒购自加拿大Stem cell公司；二脒基苯基吲哚购自美国Sigma公司；大鼠IL-10、肿瘤坏死因子α（TNFα）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自美国R&D公司；DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司；ExScriptTM逆转录试剂盒、Premix Ex TaqTM 实时定量PCR试剂盒（SYBR Green荧光染料型）购自日本TaKaRa公司；小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。 2. 免疫磁珠细胞分选法分选：β2m-/Thy-1+ BDLSC及IL-10基因转导：雄性Wistar大鼠（180～200g）行胆总管结扎7d后断颈处死，无菌分离双侧股骨和胫骨，用培养液冲出骨髓，按照免疫磁珠细胞分选两步法步骤[8]分选出β2m-/Thy-1+ BDLSC。BDLSC培养24h后，去除未贴壁细胞，然后将腺病毒介导的IL-10基因以最佳转染复数500pfu/m转导入BDLSC，继续培养24h后用于大鼠体内移植[7]。 3. CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型的建立及细胞移植：雌性Wistar大鼠50只（300～350g）被随机分为4组：（1）正常组（10只）：皮下注射橄榄油（3ml/kg），2次/周，首剂加倍，共注射8周；（2） 模型组（16只）：皮下注射体积分数40% CCl4和橄榄油（CCl4∶橄榄油＝2∶3）3ml/kg，注射次数和时间同正常组，于第4周末经门静脉分支输注1ml无菌等渗盐水（normal saline，NS），1∶1000冰冷去甲肾上腺素/NS压迫注射部位止血，关腹，正常饲养；（3）BDLSC组（12只）：造模方法同模型组，于第4 周末经门静脉分支输注BDLSC 1ml（每ml NS含BDLSC 2×105个），后续处理同模型组；（4）BDLSC/IL-10组（12只）：造模方法同模型组，于第4周末经门静脉分支输注IL-10基因修饰BDLSC 1ml（每ml NS含BDLSC 2×105个），后续处理同模型组。大鼠于造模第8 周末处死，留取肝组织备用。 4. BDLSC的移植及在肝内的定位观察：造模第4周末，随机选取模型组2只大鼠，行二脒基苯基吲哚标记BDLSC的体内移植。磷酸盐缓冲液重悬BDLSC，加入细胞核染色剂二脒基苯基吲哚（终浓度50μg/ml），4℃避光孵育2h，磷酸盐缓冲液充分洗涤6次，经门静脉分支输注至大鼠体内。2周后，断颈处死大鼠，取肝组织制成冰冻切片，其中部分切片即刻使用荧光显微镜观察，肝组织自发绿色荧光背景上有蓝色荧光代表BDLSC成功导入肝内。余切片行苏木素-伊红染色，作为普通光镜下对照。随机选取造模4周的正常组和模型组大鼠各1只，分别作为正常对照和阴性对照。 5. PCR法检测性别交叉移植BDLSC的导入情况：提取造模8周的各组肝组织基因组DNA，行PCR扩增，磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参。引物如下：Sry（NM_012772，53℃，217bp），5′-CATCG AAGGGTTAAAGTGCC-3′和5′-GCTGTTTCTG CTGTAGTGGGT-3′；GAPDH（NM_002046，58℃，450bp），5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′ 和5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，相应退火温度退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸7min。 6. ELISA法检测肝组织IL-10和TNFα蛋白水平：将每个肝组织样本精确称取100mg湿重的组织块，制备肝组织匀浆，离心，留取上清液。采用ELISA法检测上清液中IL-10和TNFα含量。 7. 实时定量RT-PCR法检测肝组织肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）基因表达：提取肝组织总RNA，按ExScriptTM逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA第一链，取逆转录产物为模板，以SYBR Green染料作为荧光标记物，在LightCycler实时定量PCR仪上行PCR扩增。引物如下：HGF（NM_017017，138bp）, 5′-AGCATGA CATCACTCCCGAGAAC-3′和5′-TGGGAA TTTGAGAGCAGTAACCAAC-3′；GAPDH (NM_017008，143bp)，5′-GGCACAGTCAAGGC TGAGAATG-3′和5′-ATGGTGGTGAAGAC GCCAGTA-3′。PCR反应条件：95℃ 10s；95℃ 5s，60℃ 20s，共40个循环；65℃ 15s。采用比较CT值法对各组HGF mRNA进行相对定量。计算公式如下：ΔCT = CTHGF-CTGAPDH，HGF mRNA相对表达量 = 2－ΔCT。 8. 苏木素-伊红染色法检测肝组织病理：肝组织石蜡切片脱蜡至水，苏木素液染色5min，1%盐酸乙醇溶液分化30s，1%伊红染色1～2min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察肝组织病理情况。 9. 免疫组织化学染色法检测肝组织增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）蛋白表达：制备肝组织石蜡切片，经二甲苯脱腊、梯度乙醇入水、微波煮沸10min以修复抗原、滴加3% H2O2孵育20min以阻断内源性过氧化酶活性后，加正常羊血清，封闭20min；加小鼠抗大鼠PCNA单克隆抗体（1∶200稀释），4℃孵育过夜；加第二抗体（1∶200稀释），37℃孵育45min；DAB显色1～3min；苏木素复染，1%盐酸乙醇溶液分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明及中性树胶封片。每个样本随机选取2张石蜡切片，应用Image-Pro plus 5.1图像分析软件计算阳性染色累积光密度，用以对PCNA蛋白的表达进行相对定量。 10. 统计学处理：应用SPSS12.0统计学软件，计量资料以x-±s表示，比较方差齐性，方差齐时采用方差分析，方差不齐时采用Kruskal-Wallis检验，P<0.05为差异有统计学意义。 结 果 1. 大鼠一般情况：同正常组大鼠相比，模型组大鼠生长缓慢、体型消瘦、毛色灰暗，部分大鼠出现腹水、黄疸等表现。BDLSC组和BDLSC/IL-10组大鼠则体质量增长较快、毛色光泽度接近正常，除BDLSC组有1只大鼠出现腹水和黄疸表现外，余大鼠未见肝硬化体征。最终进入实验统计的大鼠数量：正常组8只（造模10只，1只用于BDLSC肝内定位观察的正常对照，余9只随机选取8只进入实验统计），模型组8只（造模16只，3只用于BDLSC肝内定位观察，3只分别在第3周、第6周和第7周死亡，2只在门静脉注射过程中死亡，余8只进入实验统计），BDLSC组8只（造模12只，1只在第5 周死亡，余11只随机选取8只进入实验统计），BDLSC/IL-10组8只（造模12只，1只在第3周死亡，1只在门静脉注射过程中死亡，余10只随机选取8只进入实验统计）。结果显示，CCl4造模成功率为88.4%，移植成功率达93.2%，移植后总存活率为86.4%，经门静脉分支移植未见术中及术后感染。 2. BDLSC移植入肝的鉴定：荧光显微镜观察结果显示，BDLSC经门静脉分支成功移植入肝，移植2周后，在肝组织自发绿色荧光背景上仍存在二脒基苯基吲哚蓝色荧光（图1F），而正常对照和阴性对照则未检测到蓝色荧光信号（图1D，1E）。雄性大鼠Y染色体性别决定基因Sry PCR检测结果也显示，移植4周后，仍有外源性BDLSC种植于肝脏，BDLSC组和BDLSC-/IL-10组的肝组织均呈Sry基因阳性表达，而正常组和模型组则无（图2）。 3. IL-10基因修饰BDLSC移植对大鼠肝组织IL-10和TNFα水平的影响：与正常组相比，模型组肝组织IL-10水平降低，TNFα明显升高；同模型组相比，BDLSC组IL-10浓度有所上升，TNFα浓度有所下降，但差异均无统计学意义，而BDLSC/IL-10组IL-10浓度较BDLSC组显著升高，甚至超过正常组水平，TNFα浓度也较BDLSC组明显降低，降至正常组水平。IL-10和TNFα浓度比值（IL-10/TNFα），模型组IL-10/TNFα与正常组相比明显降低，单纯BDLSC移植未能改善比值降低情况，而IL-10基因修饰BDLSC移植则使IL-10/TNFα上升，甚至高于正常组，见表1（略）。 4. IL-10基因修饰BDLSC移植对肝组织病理损伤的影响：模型组大鼠的肝组织呈广泛而严重的肝细胞脂肪变性和坏死，门静脉和中央静脉周围炎症细胞浸润，汇管区扩大以及大量纤维组织增生；与此相比，BDLSC组和BDLSC/IL-10组大鼠的肝细胞变性坏死、炎症细胞浸润及纤维组织增生等均有所减轻，尤以BDLSC/IL-10组的肝组织病理情况恢复最好，见图3。 5. IL-10基因修饰BDLSC移植对肝细胞再生和增殖的影响：实时定量RT-PCR和免疫组织化学的检测分析结果显示，与正常组相比，模型组大鼠肝组织的HGF mRNA和PCNA蛋白表达均明显上调，分别为0.0049±0.0009（F＝84.945，P<0.01）和8511.80±4560.34（F＝82.376，P<0.01），单纯BDLSC移植使二者表达量较模型组又进一步增加，分别为0.0145±0.0022（F＝84.945，P<0.01）和15785.21 ± 6431.66（F＝82.376，P<0.01），其中BDLSC/IL-10组HGF mRNA和PCNA蛋白表达上调更多，显著高于BDLSC组，分别为0.0684± 0.0190（F＝84.945，P<0.01）和44371.43±13865.65（F＝82.376，P<0.01）。PCNA免疫组织化学结果见图4。 讨 论 基因治疗技术的兴盛和发展为我们提供了完善肝纤维化治疗的契机和途径。最近，Moore等[8]提出，基因治疗在避免移植排斥、消除免疫反应和减轻炎症损伤等方面具有巨大潜力，利用基因修饰供体组织，可以达到互补改变，有利于移植的进行和生效。抗炎症因子IL-10能控制局部炎症反应以保护肝细胞，并通过抑制炎症介质的释放和核因子κB活性等途径阻止肝纤维化的发生和发展，是肝纤维化的重要保护因子[9]。因此，我们将IL-10基因治疗与BDLSC移植同步进行，以期达到互补效果，有利于IL-10在体内稳定而持续的表达，减轻局部炎症反应，同时有助于移植细胞在纤维化肝脏内顺利增殖，促进内源性肝再生，为肝纤维化的治疗提供有利条件，这可能是单纯干细胞移植难以实现的目标。 我们在研究中选取经门静脉分支进行移植，原因有二：第一，动物实验常用经外周静脉如尾静脉注射的方法必须历经全身体内循环，导致移植细胞随处种植于全身各个器官，如肺、心及肾等，这样一方面会降低种植于肝脏的细胞数量，另一方面会因细胞携带的腺病毒的感染，给多个器官和组织带来毒性和免疫原性等，而经门静脉分支注射，靶向性好，可使大多数移植细胞直接进入门静脉而种植于肝内，提高了肝脏微环境的干细胞数量和转基因浓度，且避免了对其他器官的不必要损伤；另一方面，门静脉是肝脏主要的供血血管之一，血流量大，经其注射后不易止血，如缝合血管则动物术后死亡率增加，而选取门静脉某一分支进行细胞移植，不会过多影响随血流方向进入门静脉的细胞数量，且出血量相对较少，仅需冰冷去甲肾上腺素压迫，即可迅速止血，术后动物存活率提高，利于客观研究。我们分别通过对二脒基苯基吲哚标记的BDLSC进行示踪和性别交叉移植后Y染色体基因的检测以验证供体细胞在肝内的短期导入和长期种植情况，结果提示，经门静脉分支移植能够将BDLSC有效导入肝脏，并在肝内种植至少维持4周。 我们评价了IL-10基因修饰BDLSC移植后肝脏IL-10水平的变化及炎症反应的控制情况。由于肝脏本身有多种细胞能够分泌IL-10，如肝细胞、肝星状细胞、肝窦状隙细胞、枯否细胞和肝相关淋巴细胞等，且在肝脏损伤情况下释放增多，以下调局部炎症反应、改善肝纤维化程度，因此，本研究中所测定的肝组织IL-10含量应该包括携带IL-10基因的腺病毒载体释放的外源性IL-10和肝脏自身细胞分泌的内源性IL-10两部分。IL-10基因修饰BDLSC移植能明显提高纤维化肝组织的IL-10浓度，说明移植入肝的细胞能有效表达并释放IL-10。然而，值得指出的是，虽然BDLSC/IL-10组IL-10平均水平升高，但8例中仍有2例IL-10水平低于正常组平均值。因此我们认为，将肝组织IL-10水平单独作为评价炎症反应的指标并不全面和客观。而抗炎症因子和前炎症因子水平的比例平衡则是评估炎症反应逆转的重要参考指标[10]。所以，我们又选择了TNFα进行测定并计算了IL-10和TNFα浓度比值。TNFα是关键的前炎症因子，并能诱导肝纤维化的形成和发展[11]，IL-10和TNFα比值能够较好反映纤维化肝脏炎症反应的调节情况。结果显示，肝纤维化大鼠的肝组织IL-10和TNFα比例失衡，IL-10基因修饰BDLSC移植逆转了这一失衡，而单纯BDLSC移植则未达到逆转效果。 我们通过观察发现，IL-10基因修饰BDLSC移植较单纯BDLSC移植更能广泛而明显的改善肝纤维化大鼠的肝脏病理学，减轻炎症浸润，减少纤维增生。 肝组织肝细胞生长因子基因的表达是代表肝细胞再生的重要标志，PCNA蛋白的表达是检测细胞增殖的重要指标。肝细胞PCNA的表达可以反映细胞的DNA合成与增殖活性[12]。研究证实，IL-10基因修饰BDLSC移植能明显促进肝细胞增殖，利于肝组织的修复和再生，效果优于单纯BDLSC移植。我们考虑，IL-10基因修饰BDLSC移植使肝再生能力提高的作用机制可能有以下两点：一是BDLSC可能分泌某种利于细胞增殖的因子如肝细胞生长因子等[1]，促进BDLSC的自身增殖[13]并动员内源性肝再生[14]；二是肝内IL-10分泌的增多可能抑制炎症反应、减少细胞外基质沉积，为外源性BDLSC和内源性肝细胞的生长增殖提供空间[15]。此外，IL-10本身可能也具有直接促进肝细胞增殖的作用[16]。 IL-10基因修饰BDLSC移植能顺利种植于肝脏，提高肝内IL-10水平，有效减轻肝脏炎症反应，促进肝再生，为肝纤维化的有效治疗提供了先决条件和有利保证。那么，IL-10基因修饰BDLSC移植在发挥上述作用的基础上，对肝纤维化的程度是否具有切实的改善作用呢？基于上述研究，我们将对这一问题进行进一步探讨和阐明。 参 考 文 献 [1]Oyagi S, Hirose M, Kojima M, et al. 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