【摘要】 目的 探讨针对HBV S/C双基因位点反义锁核酸对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响。 方法 将30只HBV转基因小鼠随机分为5组，每组6只。分别为5%葡萄糖液对照组、空脂质体对照组、单靶区S组、单靶区C组、双靶区SC组。反义锁核酸片段经尾静脉注入小鼠体内，采用时间分辨免疫荧光技术定量检测血清HBsAg；实时荧光聚合酶链反应定量检测血清HBV DNA含量；逆转录聚合酶链反应检测肝组织HBV C-mRNA的表达；免疫组织化学法检测肝细胞HBsAg、HBcAg的表达；自动生物化学分析仪检测血清白蛋白、ALT、尿素氮、肌酐；小鼠肝、肾脏做常规病理切片，观察反义锁核酸对小鼠脏器的影响。应用SPSS12.0统计学软件分析。各组间比较采用重复测量方差分析的SNK检验和Kruskal Wallis H检验。 结果 注射锁核酸后，对HBsAg的表达均显示有较强的抑制作用，单靶区S组、单靶区C组和双靶区SC组的平均抑制率分别为36.6%、31.5%和54.9%；对HBV DNA的复制也有抑制作用，平均抑制率分别为24.0%、21.1%和35.8%。注射后1、3、5d，HBsAg 的平均抑制率分别为14.4%、25.6%和31.3%；HBV DNA的平均抑制率分别为11.0%、19.2%和24.1%；血清中白蛋白、ALT、尿素氮、肌酐等指标，各组结果与对照组比较，差异均无统计学意义；小鼠肝细胞的HBsAg、HBcAg阳性细胞数均较对照组明显减少。小鼠肝、肾脏组织学表现未见异常。 结论 HBV S/C基因位点反义锁核酸对乙型肝炎病毒转基因鼠HBV复制和表达有显著抑制作用，且双基因靶位优于单基因靶位。 【关键词】 脂质体； 肝炎病毒，乙型； 小鼠，转基因； 治疗 Inhibition of hepatitis B virus (HBV) replication using antisense LNA targeting to both S and C genes in HBV DENG Yi-bin, NONG Le-gen, HUANG Wei, PANG Guo-gang, WANG Yan-fei. Center for Medical Laboratory Science, the Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities, Baisei 533000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Corresponding author: WANG Yan-fei, Email: yanfeiw@ hotmail.com 【Abstract】 Objective To investigate the inhibitory effect on HBV replication of antisense locked nucleic acid (LNA) targeting to both S and C genes in HBV transgenic mice. Methods Thirty HBV transgenic mice were randomly divided into five groups (n = 6): glucose control group were treated with 5% glucose solution, liposome control group were treated with liposome alone, S group were treated with LNA targeting to S gene, C group were treated with LNA targeting to C gene, and dual-target group were treated with LNA targeting to both S and C genes. Antisense LNA was injected into mice via the tail vein. Serum HBsAg was quantified by TRFIA. Serum HBV DNA was quantified by real-time PCR. The expression of HBV C-mRNA in the liver was detected by RT-PCR. The expression of HBsAg and HBcAg in the liver was detected by immunohistochemistry. Serum ALB, ALT, BUN and CR were measured using an antomatic biochemical analyzer. The effects of antisense LNA on mouse organs were investigated by HE staining. Results 5 days after LNA injection, serum HBsAg levels in the dual-target group were reduced by 72.8%, and serum HBV DNA levels were decreased by 52.9%. These values were significantly higher than those in the control groups (all P < 0.05). No significant differences were noted in serum ALB, ALT, BUN and CR between the experiment groups and the control groups (all P > 0.05). The expression levels of HBsAg and HBcAg in the liver of dual-target group were significantly lower than those in the control groups. No significant histopathological abnormality was found in liver and kidney tissues in all groups. Conclusion Antisense LNA targeting to both S and C genes can significantly inhibit HBV replication in transgenic mice. 【Key words】 Liposomes; Hepatitis B virus; Mice, transgenic; Therapy 锁核酸（locked nucleic acid, LNA）是新发现的一种带环状结构的核苷酸衍生物,与其他寡核苷酸相比，具有更高的热稳定性、更好的分子杂交能力和更强的抗核酸酶降解能力等优势[1-3]，因而具有广阔的应用前景。我们前期研究结果表明，针对HBV S基因的LNA能有效抑制HBV的复制和表达[4]。本研究针对HBV S/C双基因设计合成LNA片段，利用阳离子脂质体的组织靶向性，经尾静脉将LNA导入HBV转基因鼠肝细胞内，进一步观察双基因位点反义LNA的抗病毒效果。 材料与方法 一、材料 1. 实验动物：HBV转基因小鼠30只，购自解放军广州军区空军医院，体质量18～ 2.主要试剂与仪器：脂质体转染试剂购自美国invitrogen公司；HBsAg定量检测试剂盒购自苏州新波生物技术有限公司；HBV DNA定量检测试剂盒购自深圳匹基生物工程有限公司；RNA抽提试剂盒购自美国Sangon公司；寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸、禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq酶、缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸等购自日本TaKaRa公司；鼠抗-HBs、鼠抗-HBc第一抗体均购自武汉博士德公司；PV-6002二步法免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；白蛋白、ALT、尿素氮、肌酐检测试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司。时间分辨免疫荧光测定仪购自美国Wallac公司；实时定量PCR仪购自美国ABI公司；热循环PCR仪购自德国BIOMETRA公司；日立7150型全自动生物化学分析仪购自日本日立公司。 二、方法 1. 反义LNA的合成与修饰：分别合成互补于HBV（ayw亚型）S基因翻译起始区157～167nt的S片段（5′-TaCcTctTgTa-3′，其中大写字母代表LNA，小写字母代表DNA）及互补于HBV C基因翻译起始区1813～1823nt的C片段（5′-TgGtAc gTtGa-3′，其中大写字母代表LNA，小写字母代表DNA）。由美国GeneLink公司合成纯化并修饰。 2. 脂质体包裹LNA的制备：脂质体与5%葡萄糖液按2∶3比例混匀后，迅速加入等体积的LNA（200mg/L）溶液，充分混匀，室温下静置1h后应用，即为脂质体-LNA混合物。 3. 转基因鼠的处理：将30只HBV转基因小鼠随机分为5组，每组6只。第1组为空白对照组（注射5%葡萄糖液），第2组为空脂质体对照组，第3组为单靶区S组，第4组为单靶区C组，第5组为双靶区SC组。分别于1、3、5d经尾静脉给每只小鼠注射相应的脂质体-LNA混合物200μl，空白对照注射等量5%葡萄糖液（或空脂质体）。于注射前，注射后1、3、5d经眶静脉采血，5000r/min离心5min，吸上层血清于编好号的无菌微量离心管中，贮存于 4. 血清HBsAg的检测：利用时间分辨免疫荧光分析法检测，具体方法见试剂盒说明书，HBsAg浓度以ng/ml表示。 5. HBV DNA的检测：在PCR反应管中加入反应液和样本DNA共25μl，各反应管放入荧光定量PCR仪，扩增条件： 6. HBV C-mRNA的检测：（1）RNA提取：注射后5d处死小鼠，取大小约为 7. 肝、肾功能检测：白蛋白用溴甲酚绿法； ALT用国际临床化学联合会推荐的速率法；尿素氮用脲酶连续监测法；肌酐用苦味酸法。以上标志物均由自动生物化学分析仪检测。测定原血清用等渗盐水1∶20稀释。 8. 肝组织HBsAg与HBcAg的检测：肝组织常规石蜡包埋、切片，采用二步法免疫组织化学法检测，并进行二氨基联苯胺试剂染色，苏木素复染，鼠抗-HBs以1∶100稀释，鼠抗-HBc以1∶40稀释，具体方法见说明书。电子显微镜观察肝组织中HBsAg与HBcAg的着色情况，以判断LNA的抑制作用。 9. 肝、肾脏器组织病理检测：小鼠的肝脏、肾脏经石蜡包埋、切片后，经苏木素-伊红染色，电子显微镜下观察小鼠各脏器组织结构有无改变，以判断脂质体对小鼠脏器细胞的损伤作用。 10. 统计学处理：数据以均数±标准差（x-±s）表示。应用SPSS12.0统计学软件分析。各组间比较采用重复测量方差分析的SNK检验和Kruskal Wallis H检验；抑制率（%）=（用药前N-用药后N）/用药前N×100%。 结 果 1． 反义LNA对HBsAg的抑制作用：小鼠注射LNA后，无论是单靶区组还是双靶区组，对HBsAg 的表达均显示出较强的抑制作用（F＝276.02，P< 0.05），单靶区S组、单靶区C组和双靶区SC组的平均抑制率分别为36.6%、31.5%和54.9%。与注射前比较，HBsAg的分泌量也明显下降（F＝210.14，P<0.05），注射后1、3、5d的平均下降率分别为14.4%、25.6%和31.3%。表明LNA在动物体内对HBsAg的抑制作用呈时间效应，且双靶区比单靶区抑制作用强，见表1。 2． 反义LNA对HBV DNA的抑制作用：LNA对HBV DNA复制有抑制作用，单靶区S组、单靶区C组和双靶区SC组的平均抑制率分别为24.0%、21.1%和35.8%。与注射前比较，HBV DNA复制也明显下降，注射后1、3、5d的平均下降率分别为11.0%、19.2%和24.1%，见表2。 3． 反义LNA对HBV C-mRNA的抑制作用：LNA对乙型肝炎病毒C基因的mRNA表达有抑制作用。1～5泳道HBV C-DNA/β-肌动蛋白（设为1）的灰度比均值分别为1.006、0.998、0.412、0.404、0.401，见图1。表明无论是单靶区组还是双靶区组均降低肝细胞内的HBV C-mRNA表达水平，但单靶区S组的抑制作用相对较低，而单靶区C组和双靶区SC组的抑制作用无明显差异。 4． 免疫组织化学检测肝组织HBsAg与HBcAg的表达：电子显微镜观察免疫组化检测结果，发现无论是单靶区组还是双靶区组，肝组织切片中的HBsAg（图2）与HBcAg（图3）阳性细胞数均较对照组明显减少，表明反义LNA可以抑制肝细胞中HBsAg与HBcAg的表达。 5. LNA对肝、肾脏组织的毒性作用：各组小鼠血清中白蛋白、ALT、尿素氮、肌酐等肝、肾脏功能指标，与对照组比较，差异均无统计学意义；各组小鼠肝、组织结构也无明显差异，说明反义LNA对小鼠肝、肾功能及其组织结构均无明显的毒性作用。 讨 论 本研究利用脂质体作为反义LNA的药物转染体系，通过其带正电荷的阳离子脂质与带负电荷的LNA序列静电作用形成缀合物，并利用脂质体的亲脂性进入肝细胞，使LNA序列慢慢释放出来，与细胞内的HBV S、C基因区互补结合，发挥抗病毒的作用。研究结果表明注射LNA后，无论是单靶区组还是双靶区组，HBsAg 的表达和HBV DNA的复制均显著下降，且双靶区组下降更为明显。注射后5d，双靶区SC组的HBsAg和HBV DNA的下降率分别达72.8%和52.9%。而免疫组织化学结果也显示肝细胞的HBsAg与HBcAg阳性细胞数均较对照组明显减少，说明由阳离子脂质体介导的反义LNA，经小鼠尾静脉注射后，能有效进入肝细胞内，发挥抗HBV复制和表达的作用，且抗病毒作用呈时间效应。由于HBV DNA多聚酶缺乏校对作用，在复制过程中易产生变异株而导致耐药现象，因此需要研究多位点联合的药物。本研究结果表明，双基因靶区较单基因靶区具有更强的抗病毒效果，这与文献报道一致[5]。同时，针对S基因的反义LNA也能明显降低肝细胞内HBV C-mRNA水平，而针对C基因和S/C双基因LNA的抑制作用却无明显差异。由于尚未进行LNA对HBV S-mRNA水平的抑制作用实验，故针对S基因的LNA也能降低C-mRNA水平的机制有待于进一步的研究。 此外，通过检测血清中的白蛋白、ALT、尿素氮、肌酐等肝、肾功能血清学标志物，同时做肝、肾脏病理组织切片苏木素-伊红染色，观察脏器的组织细胞形态学改变，评估LNA脂质体混合物的毒性作用。结果表明，反义LNA对肝、肾脏功能及其组织结构均无明显的毒性损伤作用。 互补于HBV S/C基因的反义LNA片段体外能显著抑制乙型肝炎病毒的复制与表达，且双靶区优于单靶区。因此，LNA有望成为抗乙型肝炎病毒基因治疗的新型核酸药物。 参 考 文 献 [1]Swayze EE, Siwkowski AM, Wancewicz EV,et al.Antisense oligonucleotides containing locked nucleic acid improve potency but cause significant hepatotoxicity in animals.Nucleic Acids Res, 2007, 35: 687-700. [2]Elm閚 J, Thonberg H, Ljungberg K, et al. Locked nucleic acid (LNA) mediated improvements in siRNA stability and functionality. Nucleic Acids Res, 2005, 33: 439-447. [3]Castoldi M, Schmidt S, Benes V, et al. A sensitive array for microRNA expression profiling (miChip) based on locked nucleic acids (LNA). RNA, 2006, 12: 913-920. [4]Tang Y, Wang YF. Initial study on inhibition of HBV expression by Locked nucleic acid directed at HBV S gene. 唐盈，王燕菲.针对HBV S基因的反义锁核酸抗乙肝病毒表达的初探.江西医药，2006,41:205-208. [5]Zhao W,Chen H,Peng ZY, et al. Antiviral effects of dual-target antisense RNA:an experimental study with hepatitis B virus transgenic mice. Zhonghua Yixue Zazhi, 2005, 85: 3486-3490. (in Chinese) 赵蔚,陈红,彭炤源,等.双靶区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因小鼠抗病毒疗效的研究.中华医学杂志，2005，85:3486-3490.
中华肝脏病杂志版权 |