转化生长因子β1活化肝星状细胞反式激活新基因剪切体的功能

蓝贤勇  武会娟  张跃新  张建龙  李燕

【摘要】  目的  探讨反式激活新基因剪切体TTG1A的生物学功能和参与肝纤维化的致病机制。 方法  应用酵母双杂交系统3，将PCR扩增的TTG1A基因与酵母表达载体pGBKT7连接，转化酵母细胞AH109，并在其内表达，而后与转化了人白细胞文库的质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合，在涂有X-α-gal营养缺陷型培养基上进行双重筛选，提取阳性酵母克隆的质粒转化大肠杆菌经BglⅡ酶切后测序，进行生物信息学分析。 结果  成功构建了重组酵母表达载体pGBKT7-TTG1A。应用酵母双杂交系统3从人白细胞文库中筛选出19个与TTG1A相互作用的蛋白，其中包括人类主要组织相容性复合物Ⅱ型DPβ(HLA-DPβ)、人类核糖体蛋白L30、人类核磷蛋白B23、人类核组蛋白2、人类ash2、人类变异的家族性脾性贫血和变异的异染性脑白质营养不良相关蛋白、人类死亡因子4(MORF4L1)、人类遍在蛋白偶连酶E2L3、人类载脂蛋白A-1（APOA1）、人类半乳凝素1以及5个未知功能蛋白。 结论  成功构建了重组酵母表达载体pGBKT7-TTG1A，初步揭示了新基因TTG1A的生物学功能，为进一步研究TGFβ1介导的肝纤维化分子发病机制中的作用提供基础。

【关键词】  转化生长因子β； 肝星状细胞； 肝硬化； 基因，TTG1A 

Function of TTG1A in hepatic stellate cells    XIAO Lin, CHENG Jun, ZHANG Li-ying, GUO Jiang, HONG Yuan, ZHANG Li-juan, LUN Yong-zhi, LAN Xian-yong, WU Hui-juan, ZHANG Yue-xin, ZHANG Jian-long, LI Yan. Institute of Infectious Diseases, Beijing Ditan Hospital, Beijing 100015, China

Corresponding author: CHENG Jun, Email: cj@ genetherapy.com.cn

Co-corresponding author: ZHANG Yue-xin, Email: zhangyx3103@ 163.com

【Abstract】    Objective    To investigate the biological functions of TTG1A in liver fibrosis. Methods    Yeast two-hybrid system was used to screen proteins associated with TTG1A. Briefly, the coding sequence of TTG1A was cloned into pGBKT7 vector, and the recombinant plasmid was transformed into yeast cells AH109 ( a type), then these cells were mated with yeast cells Y187 (α type) transformed with human leukocyte cDNA library plasmid pACT2. The obtained diploid yeast cells were plated on synthetic dropout nutrient medium containing X-α-gal for double selection. The plasmids from positive colonies were transformed into E.coli and sequenced. Results    The recombinant yeast expression vector pGBKT7-TTG1A was successfully constructed. Nineteen TTG1A binding proteins, including homo sapiens major histocompatibilitycomplex, class II DP beta 1 (HLA-DPβ1), homo sapiens ribosomal protein L30 (RPL30), homo sapiens nucleophosmin homo sapiens nucleobindin 2 (NUCB2), homo sapiens ash2, variant Gaucher disease and variant metachromatic leukodystrophy, MORF4L1, homo sapiens ubiquitin-conjugating enzyme E2L3 (UBE2L3), APOA1, homo sapiens lectin, and galectin 1, were idedtified. Conclusions    This study may help to elucidate the molecular function of TTG1A.

【Key words】     Transforming growth factor beta;    Hepatic stellate cells;    Liver cirrhosis;   Gene, TTG1A

在研究肝纤维化的分子发病机制过程中，我们应用基因芯片技术筛选到转化生长因子β1 (TGFβ1)刺激肝星状细胞的反式激活新基因[1]，命名为TTG1，并在GenBank注册，收录号为DQ323046。在对这一新基因进行克隆化研究过程中，意外发现了该基因的剪切体，命名为TTG1A，GenBank收录号为DQ529299。本研究旨在应用酵母双杂交技术从白细胞文库中筛选TTG1A蛋白结合蛋白，以期对这一新基因的生物学功能有深入的了解，为进一步阐明肝纤维化的发生机制提供依据。

材料与方法

1．试剂与仪器：AH109酵母菌株、Y187酵母株、pGBKT7 DNA-BD克隆载体、pGADT7 AD克隆载体、pGBKT7-53对照质粒、pGADT7-T对照质粒、pGBKT7-Lam对照质粒、pCL1对照质粒、酿酒酵母、X-α-半乳糖苷酶（X-α-gal）、酵母YPDA培养基、SD/-Trp培养基、SD/-Leu培养基、SD/-Trp/-Leu培养基、SD/-Trp/-Leu/-His培养基、 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基均购自美国Clontech公司。预转化的cDNA白细胞文库（Y187）、HepG2细胞为北京地坛医院传染病研究所保存。感受态DH5α为北京地坛医院传染病研究所制备和保存。T4 DNA连接酶、EcoRⅠ和BamHⅠ购自大连宝生物公司，Nde1、Pst1、T4 DNA连接酶购自日本TaKaRa公司。醋酸锂购自美国Sigma公司。

2．“诱饵”质粒的构建：利用生物软件Vector NTI设计新基因TTG1A的序列特异性的引物(含有特异性核酸内切酶Nde1/Pst1)，正义链引物：5′-CATATGATGGGAAGAACCTACATTG-3′，引入Nde1酶切位点，反义链引物：5′-CTGCAGCTAA TCACTGAAGTAATGA-3′，引入Pst1酶切位点。提取HepG2细胞的总RNA，进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），用玻璃奶法回收PCR产物与pGEM-Teasy克隆载体连接，转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆经菌落PCR及测序鉴定。碱裂解法提取质粒，用设计的内切酶Nde1/Pst1消化pGEM-Teasy-TTG1A及pGBKT7质粒，酶切产物用9g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，确认质粒均已酶切。回收线性化质粒片段和TTG1A目的基因片段，然后与pGBKT7载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，碱裂解法提取质粒，用Nde1和Pst1酶切鉴定，同时应用Vector NTI Suite 8.0软件分析重组质粒，选用BamH1、EcoR1再次进行酶切鉴定，确定重组质粒构建正确。

3．醋酸锂法转化AH109 酵母菌[2]：将酶切鉴定正确的“诱饵”重组质粒水溶后用醋酸锂法转入酵母细胞AH109，在四缺培养基上培养排除其自身激活作用。

4．酵母配合实验：挑取在SD/-Trp培养基上生长的pGBKT7-TTG1A质粒的AH109酵母菌落(> 2mm)数个接种于SD/-Trp液体培养基中，30℃ 250r/min振摇16～24h，当A600在0.8～1.0 时与400μl白细胞文库的酵母细胞在50ml 2×YPDA中30℃ 30～45r/min配合18～24h，可观察到三叶草状的二倍体细胞，将其重悬于10ml的0.5×YPD培养基中，分别取250ml铺于150mm的SD/-Trp/-Leu/-His三缺培养基和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade四缺培养基上（各25块），30℃培养。同时将配合产物按1∶10，1∶100，1∶1000铺于SD/-Trp/-Leu培养基上检验配合效率。生长6～18d后直至菌落出现，挑取直径大于3mm的菌落再次接种于铺有X-α-gal的四缺培养基上30℃培养4～8d，检查X-α-gal的酶活性，在四缺培养基上生长且出现蓝色菌落的为真阳性菌落。

5．酶切鉴定及测序：制备电转化感受态细胞，提取阳性酵母质粒并用电穿孔法转化大肠杆菌，于含有氨苄青霉素的LB液体培养基培养，用碱裂解法提取质粒后用BglⅡ酶切，酶切产物经9g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定证明有插入片段后送相应的菌液测序，测序结果在GenBank数据库进行同源性分析。

结    果

1. TTG1A“饵”载体的鉴定：用特异引物扩增TTG1A基因，9g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定显示扩增片段约为1296bp（图1），与预期片段相符合。回收扩增产物与pGEM-Teasy克隆载体连接，转化大肠杆菌，菌落PCR鉴定阳性克隆，用碱裂解法提取质粒，用设计的酶切位点进行酶切（图2），酶切鉴定正确后送测序。将纯化后的TTG1A基因片段与pGBKT7载体连接，得到“诱饵”载体pGBKT7-TTG1A，转化大肠杆菌，行菌落PCR及双酶切鉴定(图3，4)。酶切鉴定正确表明pGBKT7-TTG1A“诱饵”质粒构建成功。

2．单倍体酵母的配合及显色反应：将在SD/-Trp培养基上生长的pGBKT7-TTG1A质粒的AH109酵母菌落与白细胞文库的酵母细胞配合培养20h时，在倒置显微镜下观察到了三叶草状二倍体细胞，说明酵母配合培养成功。在SD/-Trp/-Leu/-His平板上共挑取100个单克隆，在铺有X-α-gal的四缺和三缺培养基上划线，变为蓝色的菌落为真阳性克隆。

3．部分筛选克隆BglⅡ酶切鉴定结果：筛选在四缺和三缺培养基上划线后均变蓝色的阳性克隆转化大肠杆菌，提取质粒后进行酶切鉴定。pACT2内含有两个BglⅡ酶切位点，分别位予多克隆位点两侧，使用该酶消化，琼脂糖凝胶电泳后可见不同大小的白细胞cDNA文库片段（图5）。

4．cDNA测序与同源性分析初步结果：挑选28个克隆进行测序，测序结果与GenBank数据库进行初步比较，14个克隆与已知基因的部分序列高度同源，5个克隆与未知基因的部分序列高度同源性见表1。

讨    论

蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行一切代谢活动的基础。研究蛋白-蛋白分子之间的相互作用，是目前功能基因组学及蛋白质组学研究的重要内容。研究蛋白质间的相互作用有多种方法，常用的技术有酵母双杂交系统、亲和层析、免疫沉淀、蛋白质交联等，其中，酵母双杂交系统是当前发展迅速、应用广泛的主要技术[3]。本研究采用双杂交系统3，利用a型和α型酵母配合形成二倍体细胞及细胞内诱饵质粒与文库质粒所表达的蛋白质可以相互作用的原理，筛选了人白细胞文库中TTG1A蛋白的结合蛋白基因。

人类主要组织相容性复合体（MHC）称为人白细胞抗原（HLA）系统。MHC基因区由三类MHC基因所组成，即Ⅰ类基因、Ⅱ类基因和Ⅲ类基因。HLA-Ⅰ类基因编码HLA-A，B，C及E～L座位上的抗原，这些抗原分布于所有的组织细胞上，为细胞膜上的移植抗原，是引起移植后排斥反应的主要抗原。HLA-Ⅱ类基因编码HLA-DR，DQ，DP等座位上的抗原，这些抗原主要分布于免疫细胞上，它们可以作为免疫细胞间识别标记而诱发免疫应答和调节免疫细胞间的相互作用。HLA是目前所知的最具有高度多态性的遗传系统，作为个体组织细胞的遗传标志，具有向抗原特异性T细胞受体传递抗原多肽的生物学特性，在抗原识别、免疫应答和免疫调控，破坏外来抗原靶细胞方面起着重要作用。本研究从人白细胞文库中筛选到HLAⅠDPβ是TGFβ1反式激活新基因剪切体TTG1A的相互作用蛋白，揭示了免疫调节机制在肝纤维化发生、发展中处于不可忽视的地位。近年来，TGFβ1基因多态性与肝纤维化之间的关系已成为人们关注的热点[4]，深入探讨HLA-DPβ与TGFβ1基因多态性之间的关系可能在肝纤维化易感基因的研究中有新的发现，这将为今后筛检易感人群及个体危险度的评价提供重要的方法。

本研究有3个克隆筛选到同一个基因：人类遍在蛋白偶连酶E2L3。细胞内的蛋白质合成及蛋白质降解对机体的生长发育、维持机体的生理平衡具有重要作用，二者在生命过程中具有同样重要的地位。在真核生物细胞，蛋白质的泛素化修饰是仅次于磷酸化的最常见的调控过程之一，泛素-蛋白酶体通路是蛋白质选择性降解的主要方式。泛素-蛋白酶体系统包括泛素化系统和蛋白酶体，其中，泛素化系统包括泛素、泛素活化酶、泛素偶连酶和泛素连接酶。越来越多的研究证实泛素-蛋白酶体途径异常与诸多疾病如恶性肿瘤、神经变性疾病、遗传性疾病、炎症、心肌病、自身免疫性疾病等有关[5-6]。业已明确肝纤维化的发生是细胞外基质成分产生和降解失衡，导致细胞外基质在肝内过度沉积的病理过程。本研究提示泛素-蛋白酶体通路异常可能是肝纤维化发生过程中细胞外基质降解失衡的重要机制之一，人类遍在蛋白偶连酶E2L3与TTG1A相结合可能是阻碍泛素-蛋白酶体通路的关键因素。

载脂蛋白是一类能与血浆脂质结合的蛋白质，是构成血浆脂蛋白的主要成分。载脂蛋白AⅠ在体内具有许多重要的生理功能，如作为高密度脂蛋白的结构蛋白；作为配基与脂蛋白受体结合；作为一种辅助因子，参与激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶，使游离胆固醇酯化等。以往的研究证实载脂蛋白对动脉粥样硬化的发生和发展有很大的影响，目前其与肝脏疾病的关系也逐渐引起关注。最近的研究结果显示，血清脂代谢谱与基因2型HCV感染者的病毒载量密切相关，认为调控脂质代谢紊乱有可能促进抗病毒应答[7]。王琳等[8]应用酵母双杂交技术筛选并用回交实验证实了HCV核心蛋白与载脂蛋白A1的相互作用，研究结果部分解释了HCV感染后普遍引起肝脂肪变性的发病机制。结合本研究结果，TGFβ1反式激活新基因剪切体TTG1A可以和载脂蛋白A1相互作用，推测脂质代谢异常可能是HCV感染致肝脂肪变和TGFβ1致肝纤维化的共同途径。

半乳凝素-1属于半乳凝素家族成员，是能够广泛与细胞表面和细胞外基质的β-半乳糖基糖缀合物结合的蛋白质，能穿梭于胞核和胞质，与胞核和胞质内的蛋白质作用，在细胞黏附、细胞生长和分化、RNA转运和剪切以及细胞骨架形成上起着极其重要的作用[9-10]。这些作用在肿瘤相关研究中有较多报道，研究表明半乳凝素在多种恶性肿瘤组织中表达，与肿瘤的发生、发展、转移、侵袭及机体的抗肿瘤免疫等方面密切相关[11]。关于半乳凝素-1与肝纤维化的关系，文献报道较少，而整合素在肝纤维化发病中的作用日益受到重视[12-13]，整合素α6β1是特异的层黏连蛋白受体，肝纤维化时它在肝窦内皮细胞表达增加。本研究发现半乳凝素-1能够与TGFβ1反式激活新基因剪切体TTG1A相互作用，认为TGFβ1参与的肝纤维化机制可能与半乳凝素-1直接与细胞外黏附分子特异性结合上调整合素的表达，促进细胞-细胞、细胞-细胞外基质之间的黏附有关。

核糖体蛋白除参与蛋白质的生物合成外，对细胞的分裂、增殖、分化等具有重要的调节功能，核糖体蛋白异常，必然对细胞的生理活动产生严重影响。近年来的研究表明核糖体蛋白基因异常(包括突变和表达异常)与许多遗传性疾病、肿瘤发生有密切关系。有作者对肝癌患者重组cDNA表达文库的血清学进行分析，拟鉴定肝癌患者中免疫监测系统特异性识别的抗原，结果显示20%的患者对核糖体蛋白L30（RPL30）抗原产生了特异性的体液免疫应答[14]。目前对核糖体蛋白调控多种生理活动的作用机制以及核糖体蛋白基因异常导致疾病发生的机制还不清楚，这将是今后核糖体蛋白研究的重要课题和方向。

本研究应用酵母双杂交技术从人白细胞文库中筛选到了TGFβ1反式激活新基因剪切体TTG1A的相互作用蛋白，这些蛋白基因主要与免疫调节、泛素-蛋白质降解、脂质代谢、细胞黏附、肿瘤发生、细胞凋亡等生物学功能有关，推断TGFβ1介导肝纤维化的机制可能与抑制蛋白酶体通路、影响肝星状细胞凋亡、促进细胞-细胞外基质之间的黏附、干扰脂质代谢等活动有关，同时也为阐明TGFβ1致肝纤维化的基因多态性找到了可能的线索。本研究得到的结果是基于初步的筛选，确切的结论还有待于后续实验加以验证。

参  考  文  献

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