活化大鼠肝星状细胞的蛋白质表达谱

【摘要】  目的  用在线二维纳升高效液相结合串联质谱（2D nanoLC-MS/MS）技术分析体外培养大鼠原代肝星状细胞（HSC）的蛋白质表达谱。 方法  分离培养大鼠原代HSC，取体外培养第10天自动活化的大鼠HSC总蛋白质，通过2D nanoLC-MS/MS对酶解所获肽段进行分离和鉴定，并对鉴定的蛋白质进行细胞定位和功能分类。 结果  从50μg HSC总蛋白质中鉴定出1014种蛋白质，相对分子质量范围为7832～588364；主要分布于细胞核、细胞骨架、线粒体、内质网，分别占25%、17%、13%、13%。蛋白质功能主要与核酸代谢、细胞器组装、信号传导、能量代谢等生理进程有关，分别占17%、14%、10%、9%；其中细胞骨架蛋白α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白和结蛋白是活化大鼠HSC特异性表达的蛋白质。 结论  本研究获得了目前较为全面的活化大鼠原代HSC的蛋白质表达谱，为深入研究HSC的活化机制奠定了基础。

【关键词】  肝星状细胞； 蛋白质组； 串联质谱分析； 二维纳升高效液相

Comprehensive proteome profile of activated rat hepatic stellate cells   JI Ju-ling*, ZHANG Jin-sheng, WANG Xue-qing, JI Yu-hua. *Department of Pathology, College of Medicine, Nantong University, Nantong Jiangsu 226001, China  

Corresponding author: JI Yu-hua, Email: tjiyuhua@ office.jnu.edu.cn, Center of Transplantation and Immunology, Jinan University, Guangzhou 510632, China

【Abstract】    Objective    To profile the protein expression in activated rat hepatic stellate cells (HSCs). Methods    Primary rat HSCs were isolated and cultured in vitro. After 10 days in vitro culture, the HSCs were activated. Total protein extracted from these activated HSCs were digested, and the obtained peptides were analyzed by using online 2D nanoLC-MS/MS. The identified proteins were classified according to their distrbutions and functions. Results    1014 proteins were identified from 50μg HSCs protein extract, the molecular weights of these proteins ranged from 7832 Da to 588 364 Da. Most of these proteins resided in nucleus, cytoskeleton, mitochondrion and endoplasmic reticulum. And these proteins were mainly involved in nucleic acid metobolism, organelle organization, signal transduction and energy generation. Among these proteins, alpha-smooth muscle actin, vimentin and desmin were specifically expressed in activated HSCs. Conclusion    To the best of our knowledge, this is the most comprehensive protein expression profile of activated rat HSCs.

【Key words】     Hepatic stellate cell;     Proteome;     Tandem mass spectrometry;    Two dimensional nano liquid chromatography

肝星状细胞（HSC）位于肝窦周隙，具有维持肝细胞外基质（ECM）平衡、储存维生素A、分泌多种细胞因子及调节肝血窦直径的功能。在急性和慢性肝损伤中，HSC活化并转化为肌成纤维细胞是导致肝纤维化的关键。因此，探讨HSC的活化机制，抑制HSC活化是治疗肝纤维化的重要策略[1]。本研究采用在线二维纳升高效液相结合串联质谱分析技术（two dimensional nano liquid chromatography and tandem mass spectrometry, 2D nanoLC-MS/MS）对体外培养自动活化的大鼠原代HSC的总蛋白质进行分析，以提供较为全面的活化原代大鼠HSC的蛋白质表达谱，可为深入研究HSC的活化机制奠定基础。

材料与方法

1. 动物与主要试剂：清洁级雄性SD大鼠（体质量350～400g）购自上海中国科学院实验动物中心。DMEM培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司。二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT）、测序级胰蛋白酶购自美国Promega公司；超纯尿素购自美国Sigma公司；乙腈购自德国Merck公司；甲酸购自美国Fluka公司；Milli-Q超纯水购自美国Millipore公司；碘乙酰胺（indoacetamide, IAA）及Brandford蛋白质浓度测定试剂盒购自美国Biorad公司；喷针购自美国New Objective公司。

2．大鼠原代HSC的分离培养和鉴定：大鼠原代HSC的分离、培养方法参照文献[2]。所得细胞以0.04%锥虫蓝染色并进行细胞计数和活力检测，然后以1×106个/ml密度接种于细胞培养瓶或培养板中，常规培养。通过紫外线激发波长观察HSC胞质中维生素A脂滴的自发荧光、苏丹Ⅲ脂肪染色及免疫荧光检测大鼠HSC特异性标志物结蛋白（desmin），所获原代HSC纯度高于90%。体外培养第3天的HSC胞质富含脂滴，处于静止状态；第10天的HSC脂滴大部分丢失，表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）和Ⅰ型胶原，处于活化状态[2]。本实验采用体外培养第10天自动活化的大鼠原代HSC (记为D10 HSC)。

3．蛋白质样品的准备和2D nanoLC-MS/MS分析：胰蛋白酶消化80%汇合的D10 HSC，用冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，400×g离心5min，弃上清液；加入细胞裂解液［8mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCL（pH8.0）］，4℃ 15000×g离心20min，取上清液，Brandford法测定蛋白质浓度。分装、-80℃保存备用。在50μg蛋白质样品中加入终浓度为10mmol/L的DTT， 37℃ 1h还原，加入终浓度为25mmol/L的IAA，室温避光30min进行烷基化修饰；最后用100mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 稀释上述样品，使尿素浓度<2mol/L，加入质量比为1∶50的测序级胰蛋白酶，37℃孵育16h。酶解后的样品由Agilent 1100 Nanoflow HPLC（购自美国Agilent公司）和QSTAR XL MS/MS（购自美国Applied Biosystem公司）组成的在线2D nanoLC-MS/MS系统进行分析[3]。

4. 数据分析：肽和蛋白质的鉴定通过Pro ID软件（购自美国Applied Biosystem公司）进行，数据库采用IPI非冗余数据库（Rat,版本3.48），参数设定如下：MS（mass spectrometry, MS）允许误差范围为0.15amu，MS/MS（tandem MS, MS/MS）允许误差范围为0.1amu，酶漏切位点为1，固定修饰为半胱氨酸甲基化修饰，蛋白质鉴定标准为得分＞1.3 (可信度>95%)。采用Gene ontology（GO）(http://www.ebi.ac.uk) 和Gofact软件对所鉴定蛋白质进行注释、细胞定位和功能分类分析，方法参照文献[4]。

结    果

1．活化大鼠HSC的蛋白质表达谱：用在线2D nanoLC-MS/MS的高通量蛋白质组学技术，本研究从50μg活化大鼠HSC的总蛋白质中成功鉴定了1014种蛋白质。相对分子质量范围为7832（IPI 0076293）～588364（IPI 00769072）, 其中相对分子质量＜2.0×104的低分子量蛋白质占15%，＞1.0×105的高分子量蛋白质占10%（图1）。

2．活化大鼠HSC蛋白质的亚细胞定位和功能分类：根据GO编号和Gofact软件分析，所鉴定的蛋白质广泛分布于细胞核、细胞骨架、线粒体、内质网、胞质、胞外区、高尔基体、溶酶体、内涵体、过氧化物酶体、染色体和微管组织中心，其中位于细胞核、细胞骨架、线粒体、内质网的蛋白质分别占25%、17%、13%、13%（图2A）；蛋白质功能与核酸代谢、细胞器组装、信号传导、能量代谢、细胞死亡、蛋白质转运、细胞分化、氨基酸代谢、转录、细胞增殖、细胞周期、细胞黏附、离子转运、胞质组织等生理进程有关，其中参与核酸代谢、细胞器组装、信号传导、能量代谢的蛋白质分别占17%、 14%、10%、9%（图2B）。所鉴定的蛋白质中骨架蛋白α-SMA、波形蛋白（vimentin）和结蛋白是活化大鼠HSC特异性表达的蛋白质。

讨    论

活化HSC转化为肌成纤维细胞，增殖能力增强，表达α-SMA，Ⅰ与Ⅲ型胶原合成增多，基质金属蛋白酶及其抑制物分泌失衡，导致ECM蓄积，在炎症和肝组织修复中发挥重要作用[1]。大鼠原代HSC在体外培养自动活化过程中的表型转变与其在体内的活化过程相似，常被用作研究肝组织损伤修复中HSC生物学改变的模型[5]，因此，获得活化大鼠HSC蛋白质表达谱将有助于深入研究HSC的活化机制。

传统的蛋白质鉴定技术，如Western blot、免疫细胞化学，一次只能鉴定一种蛋白质，且受到抗体种类和质量的限制。近年来双向电泳结合质谱鉴定（two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry, 2DE-MS）技术被广泛应用于蛋白质组学研究，但该技术也存在诸多局限性。首先，双向电泳中蛋白质的分离依赖于其不同的相对分子质量和等电点，但具有极端等电点、相对高分子质量、高疏水性的蛋白质很难进入到等电聚焦胶条和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中，因而存在着歧视性；其次，由于一些蛋白质存在异构体，使得实际的相对分子质量和等电点发生偏移，使得同一种蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳胶上可形成多个不同的点，从而给后续的分析带来困难；最后，2DE后的蛋白质鉴定还需切胶、酶解、抽提蛋白质等多个步骤，工作复杂、耗时长，不利于高通量分析。因此，一次2DE-MS所能鉴定的蛋白质通常为数十或上百个，且多为可溶性的胞质蛋白，疏水性膜蛋白很少[6]。近年来发展起来的多维色谱与串联质谱联用的蛋白质鉴定技术（multidimensional protein identification technology）先将待分析的蛋白质混合物进行充分酶解，然后通过不同液相色谱技术的组合（如本研究所采用的强阳离子交换和反相色谱）将所得到的肽段进行分离，再进行串联质谱鉴定（2D LC-MS/MS）。与2DE相比，2D LC-MS/MS具有无歧视性、自动化程度高等优点，极大地提高了蛋白质鉴定的效率，如本研究结果所示，单次分析可鉴定上千种蛋白质[7]。此外结合一些标记方法，比如iTRAQ（isobaric tag for relative and absolute quantitation）或SILAC（stable isotope labeling with amino acids in cell culture），2D LC-MS/MS技术还可在蛋白质鉴定的同时对其进行相对定量分析，其在蛋白质组学研究中具有广阔的应用前景[8]。

先前最为完整的大鼠原代HSC蛋白质组学数据是Kristensen等[9]采用2DE-MS方法获得的，仅含157种蛋白质。本研究运用在线2D nanoLC-MS/MS技术，获得的活化大鼠原代HSC蛋白质表达谱包含1014种蛋白质，蛋白质种类较以前的报道丰富很多；相对分子质量范围更宽，其中＜2.0×104的蛋白质占15%，＞1.0×105的蛋白质占10%；在细胞中的分布广，包含了位于细胞核、细胞骨架、线粒体、内质网的多种胞质蛋白和胞膜蛋白。

与已发表的大鼠HSC蛋白质表达相关文献比较，本次研究所鉴定的1014种蛋白质中96种已有报道，占9.2%。Kristensen等[9]报道的157种蛋白质中有90种在本研究中得到鉴定，占57.3%；Kim等[10]报道的15种蛋白质中有12种在本研究中得到鉴定，占80.0%（图3）。这表明本研究所获数据与已报道的HSC蛋白质有较高的重复率，具有较高的可信度。本研究所获得的活化大鼠HSC的蛋白质表达谱既包含了活化大鼠HSC特异性表达的蛋白质，如α-SMA、波型蛋白和结蛋白；也包含已知与HSC活化、分化增殖以及细胞外基质聚集有关的多种蛋白质，如galectin、S100、热休克蛋白70、STAT6、 I型胶原等；同时还有多种参与细胞分化增殖调控、可能与HSC活化相关的新蛋白质，如Rap1a/1b、CDC42、GSPT1等。

综上所述，基于在线 2D nanoLC-MS/MS的高通量蛋白质组学技术，本研究在蛋白质鉴定的种类和亚细胞分布方面较国内外前期的同类研究有很大提高，获得了目前较为全面的活化大鼠HSC蛋白质表达谱，为今后深入探讨HSC的活化机制，寻求治疗肝纤维化、肝硬化的新靶点奠定了基础。但本研究中蛋白质表达分析尚局限于活化大鼠HSC，我们正在探索基于iTRAQ标记的差异蛋白质表达分析技术，并将其用于比较静止和活化状态HSC蛋白质的表达变化，为HSC活化机制的研究提供更丰富的信息。

参  考  文  献

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[3]Ji JL, Zeng YY, Ji YH, et al. The application of nanoLC-ESI/MS/MS in proteomic analysis of ECV304 cells. Zhongguo Binglishengli Zazhi, 2009, 25: 205-208.(in Chinese)

季菊玲,曾耀英,季煜华,等.nanoLC-ESI/MS/MS在ECV304细胞蛋白质组学研究中的应用.中国病理生理杂志,2009,25:205-208.

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