乙型肝炎病毒感染者外周血T淋巴细胞CD127的表达及其意义

【关键词】  肝炎，乙型； 携带者，肝炎病毒，乙型； T淋巴细胞； CD127

Expression of CD127 on T lymphocyte in peripheral blood of hepatitis B patients    YE Jun, CHEN Ya-bao, XU Hong-tao, ZHANG Li-xin, HUANG Jun-xing.

【Key words】     Hepatitis B;    HBV asymptomatic carriers;    T lymphocyte;    CD127

【First author’s address】   Department of Laboratory Medicine, the Taizhou People抯 Hospital, Taizhou Jiangsu 225300, China

Corresponding author: CHEN Ya-bao, Email: dingyinglinyejun@  163.com

CD127是IL-7受体α链，在维持T淋巴细胞（简称T细胞）内环境稳态过程中发挥着重要作用。在T细胞缺乏的条件下，CD127信号可以不依赖TCR刺激T细胞增殖，促进 T细胞数量的恢复。其通过抗细胞凋亡作用保证T细胞的存活，恢复外周T细胞数量，促进外周T细胞的重构，维持T细胞内环境稳态[1]。在体内效应性CD4+ T细胞的存活及向记忆性CD4+ T细胞转化过程中,CD127作为效应性T细胞向记忆性T细胞转化的标记，发挥着重要作用[2]。同时CD127在维持CD4+记忆性T细胞长期存活过程中也起着重要作用[3]。CD127作为CD8+ T细胞分化的表面标记，可以在清除病毒特异性CD8+ T细胞表面表达的重要标记。Kaech等[4]发现，在CD8+ T细胞应答时，有一部分效应细胞（5%～15%）高表达CD127，这部分CD127的表达对记忆性细胞的发育发挥重要作用。乙型肝炎的病变是由于病毒感染诱发的免疫病理反应造成的。在其发病和长期携带过程中，T细胞具有重要作用[5]。我们用流式细胞仪对乙型肝炎患者和HBsAg携带者外周血CD4+ T细胞、CD8+ T细胞表面CD127分子的表达情况进行检测，同时与HBV DNA检测结果比较，了解其在HBV感染状态中的作用及其意义。

一、材料与方法

1. 仪器与试剂：FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司，用CELLQuest软件（BD公司）获取和分析实验数据。鞘液用Systmex公司的Cellpack血细胞稀释液；荧光PCR仪器为ABI7000型。CD4-PeCy5（Code NO：MHCD0406）、CD8-PE（Code NO:MHCD0804）购自美国CALTAG公司；CD127-FITC（Clone：Ebiordr5）、CD3-APC（Code NO：MHCD0305）、同型对照鼠IgG1-FITCkIsotype Control（clone：P3）购自eBioscience公司；HBV核酸扩增荧光定量检测试剂盒购自上海科华公司。

2. 研究对象：乙型肝炎患者33例、HBsAg携带者（HBsAg阳性,但无肝炎症状和体征,各项肝功能检查正常,经半年观察无变化者）31例，来源于我院2008年4月-2009年3月感染科住院患者，诊断标准符合2000年《病毒性肝炎防治方案》[6]。所有患者均排除并发HAV、HCV、HDV及HEV等其他肝炎病毒感染，排除并发药物、乙醇等其他原因造成的肝脏损害以及并发自身免疫性肝病。另选取24例健康体检人群为对照组，其中男15例，女9例，平均年龄（35.4±8.3）岁。

3. 检测方法：（1）CD4+CD127+/CD4+、CD8+ CD127+/CD8+ T细胞的检测：所有受试者均于清晨空腹状态下抽取外周静脉血2ml，枸橼酸钠抗凝，标本在6h内测定。将试管分为两组，A组加入CD4-PeCY5和CD3-APC各5μl、CD127-FITC 20μl，同型对照用CD4-PeCY5和CD3-APC各5μl、鼠IgG1-FITC 20μl；B组加入CD8-PE和CD3-APC各5μl、CD127-FITC 20μl，CD8-PE和CD3-APC各5μl、鼠IgG1-FITC 20μl；将标本充分混匀，分别加50μl标本于上述两组试管中，震荡器上充分混匀，避光放置15min；加入溶血素2ml，充分震荡，避光放置10min。1500r/min离心5min弃上清液，加入等渗盐水2ml震荡，1500r/min离心5min弃上清液，加入等渗盐水100μl，充分震荡混匀，待测。（2）流式细胞仪器设置及数据分析：用FACSComp调整仪器FSC、SSC、FL1、FL2、FL3的电压及补偿；用CELLQuest软件获取20000个淋巴细胞进行分析；选取CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞进行分析，分别以同型对照管调整标准品的位置，在同等实验条件下，用以分析测定管。（3）HBV DNA的测定：采用碱裂解法提取血清HBV DNA，加入到已配制好的PCR反应管中，将已加样的各反应管放入ABI7000仪器反应槽内，按对应顺序设置阴性对照、定量标准品梯度以及标本。设置循环条件：50℃ 2min；94℃ 2min，94℃ 10s，60℃ 30s；循环40次；35℃ 10s。60℃时荧光检测 (检测通道：530nm），分析得出定量结果。

4. 统计学处理：采用sigmastat3.1软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差（x-±s）表示，两组样本间采用t检验进行分析，多组样本间采用One Way ANOVO的单因素方差分析进行检验，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1. 慢性乙型肝炎患者及HBsAg携带者一般情况及实验室检查结果见表1。

2. 慢性乙型肝炎患者、HBsAg携带者及正常对照组外周血CD4+细胞中CD127+细胞所占的比例（CD4+CD127+/CD4+）分别为66.08%±9.40%、61.91%±15.01%、54.38%±15.30%，CD8+细胞中CD127+细胞所占的比例（CD8+ CD127+/CD8+）分别为18.71%±8.86%、20.30%±7.71%、10.46%±9.20%。与正常对照组比较，慢性乙型肝炎患者CD4+ CD127+/CD4+、CD8+CD127+/CD8+细胞比例均降低，两者比较差异有统计学意义（t值分别为3.152、3.573, P值均<0.01）；HBsAg携带组与对照组比较，差异无统计学意义。与携带组比较，慢性乙型肝炎患者CD4+CD127+/CD4+CD8+、CD127+/CD8+细胞比例均降低，差异有统计学意义（分别为t＝2.175、P<0.05，t＝4.571、P<0.01）。

3. 慢性乙型肝炎患者和HBsAg携带者中HBV DNA阳性（>1000拷贝/ml）与阴性（<1000拷贝/ml）患者的比较见表2。结果显示，HBV DNA阳性与阴性组比较，CD4+ CD127+/CD4+的差异无统计学意义（t＝1.363，P>0.05），而CD8+CD127+/CD8+差异有统计学意义(t＝2.577，P< 0.05）。

表2 （略）

三、讨论

近年的研究结果表明，在HIV感染早期，由于免疫系统活化水平的提高及CD4+ T细胞凋亡的增加，CD4+ T细胞表面CD127的表达水平降低[7]。在病毒感染后，效应性CD4+ T细胞表面也缺乏CD127表达，随着病毒感染的减轻，部分特异性CD4+ T细胞表面可以表达CD127，使T细胞避免凋亡，分化为长期存活的记忆性T细胞，再次感染时可以快速增殖，消灭病毒。在HIV感染时，HIV特异性CD4+ T细胞因缺乏CD127的表达而凋亡，不能分化为记忆性T细胞而长期存活。CD127在CD4+ T细胞的表达缺失引起细胞凋亡及CD127+记忆性CD4+ T细胞易于被感染而死亡是HIV感染中CD4+ T细胞缺失的重要原因[8]。在对HIV感染患者血中CD8+ T细胞CD127表达情况的研究结果显示，HIV感染患者血中高表达的CD8+ T细胞被证明是CD127-亚型，CD127-CD8+ T细胞的扩增与病毒感染程度的加重及T细胞活化水平的增高直接相关，而CD8+ T细胞表面CD127表达水平降低，会引起效应性T细胞向记忆性T细胞分化的障碍，导致HIV特异性CD8+ T细胞不能长期存活[9]。IL-7和HIV Tat蛋白协同下调CD8细胞的CD127表达下调[10]。

CD127+的性记忆T细胞具有抗病毒作用，在持续表达病毒特异性的CD8+ T细胞表面CD127不表达。持续存在的病毒感染可以持续激活体内效应性T细胞，激活的效应性T细胞缺乏CD127表达。由于效应性CD8+ T细胞表面CD127表达的下调，可以促进效应性CD8+ T细胞凋亡，记忆性CD8+ T细胞耗尽，进而引起病毒的持续感染[11]。Boettler等[12]对HBV感染进行动态研究发现，在急性期当HBV被有效控制后，CD127开始在病毒特异性CD8+ T细胞表面表达，而CD127+ HBV特异的效应性CD8+ T细胞表现出明显增强的细胞增殖能力，在病毒清除后，大多数HBV特异性CD8+ T细胞为CD127+亚型。我们对乙型肝炎患者CD4+、CD8+ T细胞表面的CD127表达情况进行研究，结果显示，正常人和HBV携带者体内CD4+CD127+、CD8+ CD127+记忆性T细胞维持在稳定状态，而在乙型肝炎患者体内CD4+CD127+/CD4+、CD8+CD127+/CD8+细胞显著低于正常对照和携带者。与Lopes等[13]报道的未控制的HBV感染中CD8+T细胞CD127表达降低一致，为通过Bim介导CD8+ T细胞凋亡表达低水平CD127。而HBV DNA阳性组CD8+细胞CD127的表达显著低于阴性组，提示CD8+细胞CD127的表达与病毒的清除密切相关，CD127表达可作为乙型肝炎患者发病过程中机体免疫状态的评价指标。另外，我们是否可以通过针对CD127进行治疗，为慢性乙型肝炎的防治提供新的手段尚需要进一步的探讨。

参  考  文  献

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