【摘要】 目的 探讨姜黄素抑制肝星状细胞株HSC-T6迁徙和侵袭的分子机制。 方法 培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6，并以刀豆蛋白A（ConA）激活，以不同剂量姜黄素处理后，用Western blot检测HSC-T6基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达水平；明胶酶谱法检测其活性。同时检测HSC-T6活化前后的迁徙和侵袭情况。数据采用单因素方差分析。 结果 静息状态下HSC-T6仅表达少量MMP-2，ConA激活后MMP-2表达水平显著增加；25、50、100μmol/L姜黄素处理后，MMP-2表达水平分别减少了21.8%±5.1%、65.5%±9.2%和87.9%±11.5%，P值均＜0.05。明胶酶谱实验显示静息状态下HSC-T6表达少量MMP-2且几乎没有活性，ConA激活后MMP-2表达水平和活性显著升高；不同剂量姜黄素处理后，其表达水平和活性也呈剂量依赖性降低，P值均＜0.01。静息状态下HSC-T6很少发生迁徙和侵袭，ConA激活后HSC-T6的迁徙力和侵袭力显著增强；25、50、100μmol/L姜黄素处理后，HSC-T6迁徙数分别减少了27.5%±5.8%、54.4%±7.6%和67.1%±9.3%（P值均＜0.01），HSC-T6侵袭细胞数也呈剂量依赖性减少（P值均＜0.05）。 结论 姜黄素可能通过下调MMP-2的表达水平及其活性来抑制HSC-T6的迁徙和侵袭，进而抑制肝纤维化。 【关键词】 肝硬化； 姜黄素； 明胶酶A； 迁徙； 侵袭 Curcumine inhibits migration and invasion of hepatic stellate cells by reducing MMP-2 expression and activity HUANG Jian-xian, ZHU Bao-he, HE De, HUANG Lin, HU Ke, HUANG Bo. Department of General Surgery, Bao’an People’s Hospital, Affiliated to Corresponding author: ZHU Bao-he, Email: baohezhu@ yahoo.com.cn 【Abstract】 Objective To investigate the molecular mechanism of the inhibitory effect of curcumine on the migration and invasion of hepatic stellate cells (HSC). Methods Rat hepatic stellate cells were cultured and activated with ConA. Matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) expression and activity was determined by Western blot and gelatin zymography. Migration and invasion of HSC was assessed by wound healing assay and modified Boyden chamber assay. Results Curcumine reduced the level and activity of MMP-2 expression in activated HSC in a dose-dependent manner. When treated with 25, 50 or 100μmol/L curcumine, the expression of MMP-2 was reduced by 21.8%±5.1%, 65.5%±9.2% or 87.9%±11.5% (P < 0.05), and the activity of MMP-2 was also significently reduced by curcumine. Migration and invasion of activated HSC was also inhibited by curcumine in a dose-dependent way. When treated with 25, 50 or 100μmol/L curcumine, the migration of activated HSC was reduced by 27.5%±5.8%, 54.4%±7.6% or 67.1%±9.3% (P < 0.05), and the invasion of activated HSC was also significently reduced by curcumine. Conclusion Curcumine inhibits migration and invasion of activated HSC by reducing MMP-2 expression and activity. 【Key words】Liver cirrhosis; Curcumin; Gelatinase A; Migration; Invasion 肝星状细胞（HSC）激活是肝纤维化发生发展的中心事件，活化的HSC增殖能力增强，转化为成纤维细胞，产生大量细胞外基质，同时伴有细胞外基质降解减少[1-2]。最近研究结果表明活化HSC的迁徙、侵袭特性也发生显著改变，在肝纤维化的发生、发展过程中发挥重要作用，但其分子机制尚不十分清楚[3]。本研究探讨了姜黄素对HSC迁徙和侵袭的抑制作用及其可能的机制。 材料与方法 1. 材料与仪器：鼠肝星状细胞株HSC-T6细胞（简称HSC-T6）购自中山大学实验中心细胞库。姜黄素、刀豆蛋白A （ConA）购自美国Sigma公司，基质金属蛋白酶-2 （MMP-2）抑制剂 （OA-Hy）购自美国Calbiochem公司，MMP-2单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。细胞培养板、Transwell小室、8.0μm孔径滤膜购自美国Costar公司。电泳仪和电转仪购自美国Bio-Rad公司，显微照相系统购自日本Olympus公司。 2. Western blot检测：每孔5×105个HSC-T6种于6孔板，分别加入不同浓度的姜黄素（25、50、100μmol/L）和ConA（20μg/ml），培养24h；细胞经冷磷酸盐缓冲液洗2次，用细胞裂解液裂解细胞，收获全细胞裂解液检测蛋白质浓度。取等量样本（100μg蛋白质）用于Western blot检测MMP-2蛋白表达水平。 3. 明胶酶谱实验：每孔5×105个HSC-T6种于6孔板，分别加入不同浓度的姜黄素（25、50、100μmol/L）和ConA（20μg/ml），培养24h，细胞培养液中MMP-2活性检测参照文献[4]。取细胞培养液（总蛋白质含量约40μg），加入等体积的不含β-巯基乙醇的2×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液，上样电泳；浓缩胶用50V恒压电泳，分离胶改为100V恒定电压电泳。电泳后置于2.5% Triton X-100中慢摇洗胶3次，再将胶放入底物缓冲液中， 4. HSC-T6迁徙力的检测：将HSC-T6接种于6孔板中生长至90%融合，更换无血清培养液继续培养24h；用200μl枪尖在细胞层上作一划痕，磷酸盐缓冲液反复冲洗悬浮细胞后，更换含或不含ConA (20μg/ml)、添加不同浓度姜黄素（25、50、100μmol/L）或OA-Hy（100μmol/L）的体积分数2%胎牛血清培养液继续培养24h。随机选取5个视野，以成像系统×200倍照相后测量划痕宽度，取其平均值。 5. HSC-T6侵袭力的检测：采用改良的Boyden系统，在含有8μm微孔的聚碳酸酯膜的上表面包被20μl Matrigel (1mg/ml)，下表面包被10μl I型胶原（50μg/ml）。接种100μl含或不含ConA、添加不同浓度姜黄素（25、50、100μmol/L）或OA-Hy（100μmol/L）的HSC-T6（2×104）于上室，下室加入600μl含体积分数2%胎牛血清培养液， 6. 统计学分析：数据以均数±标均差（x-±s）表示， 用SPSS13.0软件采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。 结 果 1. 姜黄素抑制活化HSC-T6的MMP-2表达：静息状态HSC-T6中只有少量MMP-2表达，经ConA激活后，MMP-2表达水平显著增加。在25、50、100μmol/L姜黄素处理后，MMP-2表达水平分别减少了21.8%±5.1%、65.5%±9.2%和87.9%±11.5%，这种抑制效应呈剂量依赖性。与仅添加ConA的对照组比较，差异有统计学意义（P值均＜0.05）。见图1。 2. 姜黄素抑制MMP-2的活性：明胶酶谱中出现两条明胶裂解条带，7.2×104和6.6×104分别代表MMP-2酶原和活化形式的MMP-2（图2）。静息状态HSC-T6细胞培养液的酶谱中只有浅淡的7.2×104明胶裂解条带，说明静息状态下HSC-T6只分泌少量MMP-2酶原，缺乏活化形式的MMP-2。添加Con-A培养24h后，该条带明显增粗，同时酶谱中出现另外一条6.6×104的明胶裂解条带，显示HSC-T6经ConA激活后不但MMP-2表达分泌水平显著增加，同时MMP-2酶原得到激活转变为活化形式的MMP-2。添加姜黄素25、50、100μmol/L后，MMP-2酶原分别减少34.1%±6.9%、63.2%±9.1%和73.6%±10.8%，呈剂量依赖性抑制，与仅添加ConA的对照组比较，差异有统计学意义（P值均＜0.01）；活化形式的MMP-2也分别减少59.9%±5.8%、77.7%±9.7%和87.6%±12.3%，也呈剂量依赖性减少，与仅添加ConA的对照组比较，差异也有统计学意义（P值均＜0.01）。 3. 姜黄素抑制活化HSC-T6的迁徙：静息状态下HSC-T6很少发生迁徙，经ConA激活后HSC-T6迁徙数显著增加，添加MMP-2抑制剂OA-Hy后HSC迁徙数减少了68.3%±8.7%；姜黄素也可剂量依赖性地抑制活化HSC-T6的迁徙，添加姜黄素25、50、100μmol/L后，HSC-T6迁徙数分别减少了27.5%±5.8%、54.4%±7.6%、67.1%±9.3%，与仅添加ConA的对照组比较，差异有统计学意义（P值均＜0.01）。见图3。 4. 姜黄素抑制活化HSC-T6的侵袭：与细胞迁徙情况一致，静息状态下HSC-T6很少发生侵袭，平均每个高倍视野仅有（10.2±3.4）个细胞侵袭，添加ConA后HSC侵袭细胞数平均每个高倍视野增加到（88.2±18.6）个；MMP-2抑制剂OA-Hy可以显著抑制ConA激活的HSC-T6侵袭，侵袭细胞数减少到每个高倍视野（24.7±6.2）个；姜黄素也可以剂量依赖性地抑制活化HSC的侵袭，添加25、50、100μmol/L姜黄素时，平均每个高倍视野侵袭的细胞数分别减少到（62.5±12.3）个、（36.1±8.5）个、（21.4±6.6）个，呈剂量依赖性减少，与仅ConA刺激活化后的对照组比较，差异有统计学意义（P值均＜0.05）。见图4。 讨 论 正常情况下HSC位于Disse间隙，处于静息状态，表现出特定的形态学特征和生理学功能。当肝脏受到炎症等慢性损伤刺激时，肝小叶的正常结构被破坏，Disse间隙微环境发生改变，HSC被激活，发生细胞形态、增殖、代谢和功能的变化[1-2]；同时细胞的迁徙和侵袭特性也增加[5-6]。HSC迁徙是肝纤维化必须的，Okayama等[4]证实膜突蛋白缺乏小鼠由于星状细胞迁徙缺陷，在致纤维化因素作用下很少发生肝纤维化。本研究结果显示在静息状态下，HSC很少发生迁徙和侵袭；一旦被活化，HSC迁徙力和侵袭力显著增强。HSC的迁徙和侵袭导致炎症区域活化HSC数目显著增加，直接参与损伤修复；同时活化HSC也向肝内更广泛的区域移行，加速细胞外基质沉积，从而导致损伤区域的扩散，促进肝纤维化的发生和发展[7]。 活化HSC迁徙力和侵袭力增强的分子机制目前尚不十分清楚，既往研究结果提示与细胞形态、骨架结构和细胞因子等多种因素相关[5-6, 8]。最近研究结果表明，HSC迁徙和侵袭与MMP-2表达及其活性密切相关，肝纤维化时增多的血小板衍生长因子-BB、转化生长因子β1以及表皮细胞生长因子等促进活化HSC的MMP-2表达，并提高MMP-2的活性，降解胶原，从而促进HSC的迁徙和侵袭[9-11]。本研究结果显示HSC激活后，MM-2的表达水平和活性均显著提高，同时HSC发生迁徙和侵袭。MMP-2的表达和活性增加可降解Disse间隙的基底膜，改变Disse间隙中HSC的微环境，反过来激活HSC，HSC活化后分泌更多的MMP-2，二者互相促进，形成激活、表达、再激活的连锁反应，进一步促进肝纤维化的发生、发展。 切断这一连锁反应可能是防治肝纤维化的一种有效方法，既往研究也证实抑制MMP-2表达及其活性可以抑制HSC的迁徙和侵袭，进而抑制肝纤维化[10]。本研究结果显示HSC激活后MMP-2的表达水平和活性显著增加，同时促进HSC的迁徙和侵袭。姜黄素处理后MMP-2的表达和活性均剂量依赖性地受到抑制，HSC迁徙力和侵袭力也剂量依赖性地减弱；同时MMP-2抑制剂OA-Hy也可以抑制活化HSC的迁徙和侵袭。这些结果提示姜黄素可能通过抑制HSC的MMP-2表达及其活性，减少HSC的迁徙和侵袭，进而抑制肝纤维化的发生、发展。 尽管其分子机制尚需进一步研究，但越来越多的证据表明活化HSC从窦状壁的迁移和其随后向损伤区域的侵袭对纤维化的发生和发展至关重要。阻止HSC迁徙和侵袭可能是一种有效的肝纤维化治疗方法。本研究结果提示，姜黄素可通过抑制活化HSC的MMP-2表达及其活性，减少HSC的迁徙和侵袭，进而抑制肝纤维化的发生和发展。 参 考 文 献 [1]Demeule M, Brossard M, Pag M, et al. 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