JNK信号通路在非酒精性脂肪肝病形成中的作用及其机制

【摘要】  目的  观察c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号传导通路在非酒精性脂肪肝病（NAFLD）大鼠中的表达，探讨其在NAFLD发病中的作用。 方法  雄性SD大鼠64只, 随机分为8周对照组、12周对照组、8周高脂组及12周高脂组各16只，对照组喂饲普通饲料，高脂组喂饲高脂饲料。正糖高胰岛素钳夹实验技术检测葡萄糖输注率（GIR），生物化学法检测空腹血糖（FBS）、ALT、AST、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）；放射免疫法检测空腹胰岛素（FIns）、肿瘤坏死因子α（TNFα）；分光光度计测定超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、游离脂肪酸（FFAs）；Western blot检测肝组织JNK1、胰岛素受体底物1（IRS-1）、胰岛素受体底物1丝氨酸307磷酸化（p-IRS-1Ser307）、蛋白激酶B（PKB）、蛋白激酶B丝氨酸473磷酸化 (p-PKBSer473)。正态分布数据采用t检验，偏态分布数据采用秩和检验。 结果  8周高脂组与8周对照组、12周高脂组与12周对照组比较：体质量、肝指数、血清ALT、AST、TG、TC、 FIns、FFAs、TNFα、及肝匀浆TG、TC、FFAs、MDA，高脂组（8、12周）均明显高于对照组（8、12周），t值分别为5.90和7.92、9.91和7.42、5.49、4.99和5.31、7.37、2.30和5.86、2.64和3.85、3.86和6.61、10.53、7.07和8.45、T＝89.5和T＝100、5.20和6.18、11.90和17.83，P值均<0.05或<0.01。肝匀浆每毫克蛋白SOD：8周对照组、12周和8周高脂组、12周分别为（21.6±4.0）U、（22.0±3.6）U、（13.0±3.0）U、（10.1±2.2）U，高脂组明显降低，t值分别为4.88、7.92，P值均<0.01；GIR：8周对照组、12周和8周高脂组、12周分别为（10.8±1.3）mg·kg-1·min-1、（10.7±1.2）mg·kg-1·min-1、（8.1±1.1）mg·kg-1·min-1、（6.3±1.5）mg·kg-1·min-1，高脂组明显降低，t值分别为4.52、6.41，P值均<0.01；高脂组与同期对照组比较：肝组织JNK1蛋白表达、p-IRS-1Ser307水平均增高，t值分别为4.39、5.81和4.06、6.48，P值均<0.01，p-PKBSer473水平降低，t值分别为3.32、4.96，P值均<0.01。JNK1的蛋白表达强度与IR呈正相关（Pearson相关系数为0.718，P<0.01）。随着喂养时间的延长，高脂组大鼠肝细胞脂肪变性逐渐加重，8周形成NAFLD，12周可形成非酒精性脂肪性肝炎。 结论  高脂饮食可诱导肝组织JNK1增高，通过影响胰岛素信号蛋白IRS-1、PKB的磷酸化功能，导致IR从而参与了NAFLD的发生和发展。

【关键词】  脂肪肝； 胰岛素抗药性； 大鼠； 信号传导； c-Jun氨基末端激酶

Role of JNK signal transduction pathway in nonalcoholic fatty liver disease   TAN Ying, ZHANG Jia-ni, CHEN Jin-hu, WANG Li-juan, LIU Hui-xia.Department of Geriatrics,Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China

Corresponding author: LIU Hui-xia, Email: lhx900@ yahoo.com.cn

【Abstract】 Objective    To investigate the role of c-Jun N-terminal kinase (JNK) signal transduction pathway in the rats of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). Methods    Sixty four Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: 8-week control group (NG8w), 12-week control group (NG12 w), 8-week high-fat diet (HG8w), and 12-week high-fat diet group (HG12w), with 16 rats in each group. Glucose infusion rate (GIR) was tested by euglycemic hyperinsulinemic clamp;aminotransferase (ALT), aspartate aminotrans- ferase (AST), triglyceride (TG), total cholesterol (TC), free fatty acid (FFAs), fast insulin (FIns),tumor necrosis factor α(TNFα), superoxide dismutase (SOD) and  malondial- dehyde (MDA) were tested by biochemistry automatic analyzer or RIA; The expression of JNK1, insulin receptor substrate-1 (IRS-1), phospho-IRS-1Ser307 (p-IRS-1Ser307), Protien kinase B (PKB) and phospho-PKBSer473 (p- PKBSer473) were detected by Western blot. Results    Compared to control group, body weight, liver index, serum levels of ALT, AST, TG, TC, FIns, FFAs, TNFα, and TC, TG FFAs, MDA in liver homogenates were increased, while the level of SOD, and GIR were decreased. The expression of JNK1 protein and p-IRS-1Ser307 in liver tissue was up-regulated, while expression of p-PKBSer473 was decreased (P < 0.05). A positive correlation was found between the expression intensity of JNK1 and IR (Pearson correlation: 0.718, P < 0.01). Conclusion    The high-fat could induce the expression of JNK1, which in turn modulates the phosphorylation of proteins in the insulin signaling pathway, and induces insulin resistant.

【Key words】Fatty liver;  Insulin resistance;  Rats;  Signal transduction;  C-Jun N-terminal kinase

胰岛素抵抗（IR）目前被认为是非酒精性脂肪肝病（NAFLD）发病机制的中心环节[1-2]。c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路是丝裂原活化蛋白激酶家族中的重要成员，JNK信号通路在IR中起重要作用，而某些应激因子如肿瘤坏死因子α（TNFα）、游离脂肪酸（FFAs）以及氧化应激反应等可通过激活JNK信号通路从而导致IR，但JNK信号通路如何导致IR及NAFLD的确切机制不明[3-4]。本研究通过建立SD大鼠NAFLD模型，观察JNK信号通路在NAFLD大鼠中的表达，为进一步探讨NAFLD的发病机理提供理论依据。

材料与方法

1. 动物模型的建立：清洁级雄性SD大鼠 64只，体质量150～180g，鼠龄4～6周，由中南大学实验动物学部提供。实验动物经普通饲料适应性喂养1周后将SD大鼠随机分为8周对照组、12周对照组、8周高脂组和12周高脂组各16只，对照组喂饲普通饲料，其蛋白质、脂肪、碳水化合物提供能量分别为21.52%、19.03%和59.45%；高脂组喂饲高脂饲料，其蛋白质、脂肪、碳水化合物提供能量分别为14.81%、44.84%和40.35%。每周测量各组大鼠的体质量并记录。各组分别于8周和12周末随机抽取8只大鼠用于正常血糖高胰岛素钳夹实验技术（钳夹技术），观察其IR情况，其余大鼠麻醉后从门静脉采血迅速取出肝脏称取重量，计算肝指数：肝指数=肝湿重/体质量×100%。取部分肝组织行病理学检查及Western blot分析，按常规制备血清检测空腹血糖（FBS）、ALT、AST、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、空腹胰岛素（FIns）、TNFα、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、FFAs。

2. 主要试剂：凯基全蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司、BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司，JNK1小鼠单克隆抗体、胰岛素受体底物1 (insulin receptor substrate-1，IRS-1)小鼠单克隆抗体、胰岛素受体底物1丝氨酸307磷酸化（phospho-IRS-1Ser307，p-IRS-1Ser307）兔多克隆抗体及驴抗鼠第二抗体、驴抗兔第二抗体均购自美国SantaCruz公司，蛋白激酶B（protien kinase B，PKB)兔单克隆抗体购自中国碧云天生物技术研究所，蛋白激酶B丝氨酸473磷酸化 (phospho-PKBSer473，p-PKBSer473) 小鼠单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司。

3. 血清及肝匀浆生物化学指标检测：FBS、ALT、AST、TG、TC均使用全自动生物化学分析仪检测。FIns、TNFα检测采用放免法由全自动放免γ测量仪测定。SOD、MDA、FFAs采用全波长分光光度计测定。

4. 病理学检查：部分新鲜肝组织以4%甲醛溶液固定，制备冰冻切片及石蜡切片，采用苏丹Ⅳ染色及HE染色。肝脏脂肪变性程度根据中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精肝病学组制定的NAFLD诊断标准进行评价[5]。

5. IR水平的判定：采用评价IR的金标准——钳夹技术来评价胰岛素敏感性[6]：大鼠均禁食过夜12h，用戊巴比妥钠1mg/kg腹腔注射麻醉后，进行颈动脉和颈静脉插管并留置。两侧颈静脉分别泵入胰岛素、葡萄糖，血液标本由颈动脉导管获取。胰岛素输注率为10.0 mU·kg-1·min-1，从颈动脉取血，用微型血糖仪检测血糖值，维持稳态血糖在（基础血糖值±0.5）mmol/L范围内，持续上述过程达120min完成。钳夹实验结束后，计算60～120min的葡萄糖输注率（glucose infusion rate，GIR），判断大鼠的IR。

6. Western blot分析：右叶肝组织100mg，使用凯基全蛋白提取试剂盒4℃匀浆后提取胞质蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白变性后，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至聚偏二氟乙烯膜，脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入JNK1抗体（1∶500）、IRS-1抗体（1∶100）、p-IRS-1Ser307抗体（1∶100）、PKB抗体（1∶1000）、p-PKBSer473抗体（1∶500）室温作用2h，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG（1∶5000）或抗兔IgG（1∶5000），作用1h再洗膜。然后化学发光试剂检测，X光片显影。定量分析采用分子生物学图像分析系统测定各目的带灰度积分值，所测结果为扣除背景的积分吸光度。

7. 统计学处理：计量资料均以x-±s表示，两组间比较，如数据符合正态分布采用t检验，如符合偏态分布则采用秩和检验，相关分析用秩相关，P<0.05为差异有统计学意义。采用SPSS14.0统计软件进行数据处理分析。

结    果

1. 大鼠一般情况、体质量及肝指数的变化：实验过程中各组大鼠均无死亡。与同期对照组比较，高脂组大鼠性情温顺，不喜动，毛发蓬乱无光泽，大便稀软次数少，体质量：8周高脂组平均为（443.0±21.7）g、8周对照组为（370.4±27.2）g；12周高脂组为（513.0±32.63）g、12周对照组为（393.5±27.5）g，高脂组体质量高于对照组，t值分别为5.90和7.92，P值均<0.01；肝指数：8周高脂组平均为2.83±0.14、8周对照组为2.25±0.25、12周高脂组为3.54±0.37、12周对照组为2.35±0.26，高脂组肝指数高于对照组，t值分别为9.91和7.42，P值均<0.01；12周高脂组体质量、肝指数均明显升高于8周高脂组，t值分别为5.05、5.03，P值均<0.01，差异均有统计学意义。

2. 血清及肝匀浆生物化学指标检测：与同期对照组比较，高脂组血清ALT、AST、TG、TC、FIns、FFAs、TNFα及肝匀浆TG、TC、FFAs、MDA水平均明显升高，肝匀浆SOD水平降低，差异均有统计学意义。12周高脂组与8周高脂组比较，以上各项指标除肝匀浆SOD水平降低外，其余均升高，差异均有统计学意义。12周对照组与8周对照组比较以上各项指标差异均无统计学意义。各组间血糖比较，差异无统计学意义，见表1，2。

3. 肝组织病理学变化：光镜下苏丹IV及HE染色显示，对照组大鼠肝组织的形态学表现正常，而8周高脂组及12周高脂组所有动物肝组织均出现不同程度的肝细胞脂肪变性，肝细胞体积增大，细胞质内可见大小不等的脂滴空泡，肝组织脂肪变性程度与高脂饮食时间相关：8周高脂组为轻-中度脂肪变性，12周高脂组为中-重度脂肪变性并小叶内及汇管区有以单核、淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，已进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH）阶段，见图1。

4. GIR结果：大鼠GIR水平：8周高脂组平均为（8.1±1.1）mg·kg-1·min-1、8周对照组为（10.8±1.3）mg·kg-1·min-1、12周高脂组为（6.3±1.5）mg·kg-1·min-1、12周对照组为（10.7±1.2）mg·kg-1·min-1，高脂组GIR水平明显低于对照组，t值分别为4.52和6.41，P值均<0.01。12周高脂组GIR水平明显低于8周高脂组，t＝2.79，P<0.05，差异均有统计学意义。12周对照组与8周对照组 GIR水平比较，差异无统计学意义。

5. 肝组织JNK1蛋白表达、IRS-1及PKB的蛋白表达及丝氨酸磷酸化结果：与同期对照组比较，高脂组大鼠肝组织JNK1蛋白表达和p-IRS-1Ser307水平增高，t值分别为4.39、5.81和4.06、6.48，P值均<0.01，p-PKBSer473水平降低，t值分别为3.32、4.96，P值均<0.01。与8周高脂组比较，12周高脂组的JNK1蛋白表达、p-IRS-1Ser307水平升高，p-PKBSer473水平降低，差异均具有统计学意义（JNK1：t＝2.92，p-IRS1Ser307：t＝2.47，p-PKBSer473：t＝2.25，P值均<0.05）。12周对照组与8周对照组比较，以上各项指标差异均无统计学意义。各组间的IRS-1、PKB蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义，见图2。

6. 肝组织JNK1蛋白表达与IR水平相关性分析：将8周高脂组和12周高脂组的GIR与肝组织JNK1蛋白进行相关性分析后发现：GIR与JNK1蛋白表达呈明显负相关（Pearson相关系数为0.718，P<0.01）；即JNK1蛋白表达与IR水平呈正相关。

讨    论

本研究使用高脂饲料喂养SD大鼠8周，成功构建了SD大鼠NAFLD模型，12周时形成了NASH。该模型伴有IR、高胰岛素血症、高脂血症、血清转氨酶升高等代谢综合征特征，符合人类脂肪肝的特征及演变过程，造模方法简便易行，成模率高，为研究NAFLD提供了理想的模型支持。

研究表明，IR是NAFLD发病机制的关键环节，IR可由胰岛素信号通路的信号传导异常引起，而绝大多数IR是胰岛素与胰岛素受体结合后信号传导异常，即胰岛素受体后缺陷的结果[6]。胰岛素和细胞表面胰岛素受体结合后，IRS随之激活，进行自身磷酸化后激活与其相关的胰岛素信号通路，进而产生生物学效应[7-8]。在高脂饮食诱导的IR模型中，肝脏、脂肪等胰岛素敏感组织中的JNK1明显升高，JNK1与IRS-1结合使p-IRS-1Ser307增加，抑制了IRS-1的酪氨酸磷酸化，进而反馈性抑制其下游磷酯酰肌醇-3’激酶/PKB途径的活化，从而对胰岛素信号通路起负性调节作用，引起IR[3，8-9]。PKB是胰岛素信号通路上的重要分子，其Ser473位点磷酸化后可启动下游相关底物蛋白级联反应，参与糖原合成、葡萄糖转运等作用[8]。本研究结果表明，高脂饮食喂养SD大鼠8周出现明显的IR，随着喂养时间延长，IR明显加重，进一步对该胰岛素信号传导通路研究后发现，NAFLD大鼠肝组织中JNK1蛋白表达、p-IRS-1Ser307水平增加，p-PKBSer473水平下降，均呈明显时间依赖性，而IRS-1及PKB蛋白表达均正常，JNK1蛋白表达与IR呈现高度正相关。其机制可能为：高脂饮食诱导的JNK1增高后结合IRS1使p-IRS-1Ser307增加，进一步使胰岛素信号通路下游p-PKBSer473下降，PKB的活性被抑制，从而减弱了胰岛素信号传导及作用，导致IR。提示高脂饮食诱导JNK1增加后影响了与之关联的胰岛素信号蛋白的磷酸化功能从而引起IR，进一步导致NAFLD的发生和发展，因此JNK信号通路在IR及NAFLD的发病中起重要作用。

研究结果显示，IR贯穿于NAFLD发病的全过程，而脂肪细胞因子、FFAs及氧化应激等因素与IR相互作用促进了该病的发生发展，目前认为TNFα、FFAs、氧化应激均是JNK的特异性激动剂，同时也证明它们都能干扰INS信号传导从而导致IR[10]。本实验NAFLD大鼠中，TNFα、FFAs水平升高，氧化应激反应增强，且随着NAFLD病变的进展，以上异常改变逐渐加重，证实了脂肪细胞因子、脂代谢异常及氧化应激反应参与了NAFLD的形成及病变的发展。推测其可能机制为：以上各因素激发了肝细胞内JNK信号通路, 导致JNK1蛋白表达明显增高，p-IRS-1Ser307增加，p-PKBSer473减少，下调INS信号通路的传导，进而产生和加重了IR。

本研究证实了高脂喂养周可成功构建NAFLD大鼠模型，12周发展成NASH，IR是NAFLD发病机制的中心环节，而JNK信号通路的激活是IR的主要影响因素。本实验探讨了NAFLD的可能发病机制：即高脂饮食诱导JNK1增高后，导致p-IRS-1Ser307增加，其下游p-PKBSer473下降，负性调节了INS信号传导通路，引起IR，参与了NAFLD的发生和发展；TNFα、FFAs及氧化应激等因素通过激发肝细胞内JNK信号通路从而加重IR，促进了NAFLD的形成和发展。本研究为寻找临床治疗NAFLD提供了方向：对JNK信号通路的阻滞、拮抗TNFα、FFAs的作用或改善氧化应激等途径有望成为防治NAFLD的新靶点和新方法。

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