【关键词】肝星状细胞； 胶原； 细胞凋亡； 细胞增殖； sp600125 Effects of sp600125 on acetaldehyde stimulated hepatic stellate cells TANG Wen, JIANG Ming-de, LI Xiao-an. 【Key words】Hepatic stellate cells; Collagen; Apoptosis; Cell proliferation; sp600125 【First author’s address】Department of Infection, General Hospital of Chengdu Military Command, Chengdu 610083, China Email: tw2002362@sina.com.cn 肝星状细胞（HSC）的增殖与凋亡在肝纤维化的形成中起作十分重要的作用。乙醛刺激的HSC增殖是导致酒精性肝纤维化发生的关键因素[1-2]。丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）包括细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38，是HSC激活、增殖并导致肝纤维化发生的主要信号传导通路之一，其中，JNK信号传导通路参与了细胞增殖、分化以及凋亡的调控。我们既往对肝纤维化发病机制的研究结果证实，乙醛刺激的HSC中，p-JNK水平随JNK信号传导通路特异阻断剂sp600125浓度增加而减少[3]。我们用sp600125处理乙醛刺激的HSC-T6细胞株，观察sp600125对HSC-T6增殖与凋亡以及分泌Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的影响，进一步探讨酒精性肝纤维化的发生机制。 一、材料与方法 1．材料：大鼠HSC-T6细胞株购自上海中医药大学肝病研究所；sp600125购自美国Alexis公司；大鼠Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白酶联免疫吸附检测试剂盒购自美国TPI公司，小牛血清购自成都哈里生物工程有限公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司。 2．细胞培养：含100ml/L小牛血清的DMEM培养基，另添加适量的羟乙基哌嗪乙硫磺酸、抗生素；在 3．实验分组：空白对照组：加入含100ml/L小牛血清的DMEM培养液；乙醛对照组：在含100ml/L小牛血清的DMEM培养液中加乙醛200μmol/L；实验组：在乙醛对照组基础上加入sp600125，终浓度分别为25、50、75、100μmol/L，分别作为实验A、B、C、D组。 4．四甲基偶氮唑盐法检测HSC-T6增殖：取大鼠HSC-T6，调整浓度至1×105/ml接种于96孔细胞培养板中，每孔200μl细胞悬液，每组3个复孔，细胞生长至80%以上融合度时，无血清培养基同步化处理24h，实验组经sp600125预处理1h后，加乙醛200μmol/L（终浓度），CO2培养箱中继续孵育24h后（乙醛每12h补充1次）, 每孔加5 mg/ml的四甲基偶氮唑盐20μl， 5．流式细胞术测定HSC-T6细胞凋亡率：每组重复实验3次，收集培养的各组HSC-T6，预冷磷酸盐缓冲液清洗，700ml/L冷乙醇固定，50mg/L核糖核酸酶 6．Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白测定：HSC-T6 处理同上，每组重复实验3次，按照Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白酶联免疫吸附检测试剂盒说明书操作。 7．统计学方法：用SPSS10.0统计软件，用One-way ANOVA分析，并用LSD方法进行组间两两比较，数据以均数±标准差表示，P＜0.05为差异有统计学意义。 二、结果 1．HSC-T6增殖情况：在培养的HSC-T6中加入乙醛后，HSC-T6增殖明显；在加入不同浓度sp600125后，HSC-T6增殖逐渐减少（F＝25.30，P＜0.01），见表1（略）。 2．HSC-T6细胞凋亡情况：空白对照组HSC-T6凋亡率除了与实验A、B组差异无统计学意义外（P值均＞0.05），与其他组的差异均有统计学意义（P值均＜0.01）；乙醛对照组与其他组的差异均有统计学意义（P值均＜0.01）。随着sp600125浓度增加，HSC-T6细胞凋亡率逐渐增加（F＝21.72， P＜0.01），见表2。 3．Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白检测：随着sp600125浓度增加，HSC-T6分泌Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白逐渐减少（F值分别为48.58和46.59，P值均＜0.01），见表3。 三、讨论 HSC的增殖是肝纤维化发生、发展的中心环节，而HSC的凋亡有利于肝纤维化的逆转[4-5]。因而，抑制HSC增殖、诱导激活的HSC凋亡以及抑制胶原蛋白产生和沉积，是治疗肝纤维化的一个重要研究方向。 MAPK信号传导通路是细胞外的各种信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要通路，JNK为MAPK家族重要成员，JNK信号传导通路的激活在肝纤维化发生中起重要作用[6-8]。细胞外基质各组分在肝脏组织的异常沉积是纤维化形成的主要病理学特征，主要是肝脏的HSC合成并分泌大量细胞外基质的结果，合成的细胞外基质有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原等，其中以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主，抑制HSC的增殖明显减少肝纤维化基质的沉积[9-11]。我们用sp600125阻断JNK信号通路后，能抑制乙醛刺激的HSC增殖，促进HSC凋亡，HSC分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白降低，说明阻断JNK信号传导通路有利于阻止酒精性肝纤维化的发生。 参 考 文 献 [1]Anania FA, Womack L, Jiang M, et al. Aldehydes potentiate alpha(2)(I) collagen gene activity by JNK in hepatic stellate cells. Free Radic Biol Med, 2001, 30: 846-857. [2]Svegliati-Baroni G, Ridolfi F, Di Sario A, et al. Intracellular signaling pathways involved in acetaldehyde-induced collagen and fibronectin gene expression in human hepatic stellate cells. Hepatology, 2001, 33: 1130-1140. [3]Zhong XF, Jiang MD, Ma HD, et al. Effects of JNK signal pathway on proliferation of hepatic stellate cells stimulated by acetaldehyde in rats. Xi抧an Guofang Yiyao, 2004, 14: 350-353. (in Chinese) 钟显飞,蒋明德,马洪德,等.JNK信号通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增殖的影响.西南国防医药,2004,14:350-353. [4]Iredale JP, Benyon RC, Pickering J, et al. Mechanisms of spontaneous resolution of rat liver fibrosis. Hepatic stellate cell apoptosis and reduced hepatic expression of metalloproteinase inhibitors. J clin Invest, 1998, 102: 538-549. [5]Kmiec' Z. Cooperation of liver cells in health and disease. Adv Anat Embryol Cell Biol, 2001, 161: III-XIII, 1-151. [6]Marra F, Delogu W, Petrai I, et al. Differential requirement of members of the MAPK family for CCL2 expression by hepatic stellate cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2004, 287: G18-26. [7]Li J, Hu W, Baldassare JJ, et al. The ethanol metabolite, linolenic acid ethyl ester, stimulates mitogen-activated protein kinase and cyclin signaling in hepatic stellate cells. Life Sci, 2003, 73: 1083-1096. [8]Cariers A, Reinehr R, Fischer R, et al. c-Jun-N-terminal kinase dependent membrane targeting of CD [9]Chan HL, Tse CH, Mo F, et al. High viral load and hepatitis B virus subgenotype ce are associated with increased risk of hepatocellular carcinoma. J Clin Oncol, 2008, 26: 177-182. [10]Sebastiani G, Vario A, Guido M, et al. Performance of noninvasive markers for liver fibrosis is reduced in chronic hepatitis C with normal transaminases. J Viral Hepat, 2008, 15: 212-218. [11]
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