【关键词】肝硬化; 肝星状细胞; 细胞凋亡; 基因,bcl-2; 莪术油 Preliminary research on the mechanism of apoptosis hepatic stellate cells induced by zedoary turmeric oil LIU Hong-yan, PEN An-bang, LIAO Ai-jun, SHI Wei. 【Key words】Liver cirrhosis; Hepatic stellate cells; Apoptosis; Gene, bcl-2; Zedoary turmeric oil 【First author’s address】Department of Digestive, First Affiliated Hospital, Nanhua University, Hengyang Hunan 421000, China Email: lhy81833@163.com 在各种治疗肝纤维化的方法中,以肝星状细胞(HSC)为靶点成为目前的研究热点[1-2]。国艳等[3]研究发现,莪术油注射液对体外培养的HSC有明显促凋亡作用,但其凋亡机制尚不清楚。我们进一步检测和证实了莪术油注射液对HSC的促凋亡作用;并同时检测促凋亡基因Fas、抑凋亡基因bcl-2与凋亡蛋白酶caspase-3,试图揭示莪术油注射液促进HSC凋亡作用的可能机制。 一、材料与方法 1. 实验材料:(1)细胞株:HSC系HSC-T6细胞由上海中医药大学徐列明教授提供,系SV40转染的大鼠HSC,具有活化HSC的表型。(2)主要试剂:高糖DMEM购自美国Sigma公司;胰蛋白酶购自美国Gibco公司。兔抗大鼠caspase-3单克隆抗体、SABC免疫细胞化学染色试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司;莪术油注射液购自华夏药业集团有限公司(批准文号:国药准字H20043217);RNA提取试剂盒(Rneasy)、逆转录PCR试剂盒购自美国Omega公司, 各种引物购自北京赛百盛基因技术有限合成公司;Bcl-2 mRNA及Fas/FasL基因试剂盒、caspase-3抗体及免疫细胞化学试剂盒购自北京中山公司。 2. 实验方法:(1)HSC-T6细胞培养:加10%小牛血清的高糖DMEM于 3. 统计学处理:实验数据采用均数±标准差(x-±s)表示,应用SPSS13.0统计软件进行单因素或两因素方差分析,P < 0.05为差异有统计学意义。 二、结果 1. 莪术油注射液对HSC-T6细胞凋亡的影响:(1)流式细胞仪检测细胞凋亡:空白对照组、莪术油注射液20、40、60μg/ml组凋亡率分别为5.89%±0.39%、35.43%±5.04%、41.95%±3.92%、55.70%±5.56%,与各组间比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。(2)DNA断裂分析: 琼脂糖凝胶电泳结果显示空白组无DNA断裂,而在20、40、60μg/ml莪术油处理后凋亡细胞形成200bp左右间距的明显DNA梯度带(图1)。 2. 免疫细胞化学法检测凋亡蛋白:20、40、60μg/ml莪术油处理HSC-T6细胞12、24、48h后,caspase-3蛋白免疫细胞化学染色结果显示正常对照组中仅有少量棕黄色颗粒沉积,而20、40、60μg/ml莪术油处理的细胞中细胞核着色逐渐增多,各组caspase-3阳性率见表1。经两因素三水平重复测量的方差分析统计及球性检验结果显示P=0.471,满足了协方差距陈球对称,不需校正。不同浓度莪术油组之间存在差别,F=1916.213,P<0.01;不同时间之间存在差别,F=967.212,P<0.01;莪术油浓度与时间之间存在交互作用,F=248.941,P<0.01;即caspase-3阳性率随莪术油浓度增加及时间的延长逐渐升高,呈现量效与时效关系,与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P值均<0.01)。 表1 不同浓度莪术油处理HSC-T6后caspase-3的 阳性表达率(x-±s) 作用不同时间的caspase-3阳性表达率(%) 组别 12h 24h 48h 空白对照组 2.19±0.31 4.75±0.24 5.75±0.31 莪术油20μg/ml 8.53±0.45 9.98±0.53 12.78±0.74 莪术油40μg/ml 14.51±0.45 27.43±1.82 41.00±1.51 莪术油60μg/ml 28.90±2.37 39.11±1.19 71.33±2.68 3. Fas/Fasl mRNA、Bcl-2 mRNA的表达:(1)不同浓度莪术油对肝星状细胞Bcl-2 mRNA表达的影响:琼脂糖凝胶电泳结果显示,在118bp处均可见到均匀一致的β-肌动蛋白基因条带;各组在403bp处均可见到Bcl-2 mRNA表达,空白对照组HSC-T6细胞强表达,不同浓度莪术油处理后,其表达呈浓度依赖性减弱(F=371.245,P<0.01);组内分析表明,空白对照组及莪术油20、40、60μg/ml组(灰度值分别为0.757±0.005、0.718±0.006、0.661±0.009、0.586±0.008)之间两两比较,差异有统计学意义(P值均<0.01)。(2)不同浓度莪术油对肝星状细胞Fas/Fasl mRNA表达的影响:琼脂糖凝胶电泳结果显示,在118bp处可见到均匀一致的β-肌动蛋白基因条带;各组在307bp处均可见到Fas/Fasl mRNA表达,空白对照组细胞弱表达,不同浓度莪术油处理后,其表达呈浓度依赖性增强(F=24.282,P<0.01);其中空白对照组(灰度值为0.770±0.026)与莪术油20、40、60μg/ml组(灰度值分别为0.820±0.010、0.903±0.025、0.963±0.074)比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);各药物浓度组间比较差异有统计学意义(P值均<0.05)。 三、讨论 HSC的活化、增殖是肝纤维化发生、发展的中心环节。持续的HSC凋亡可逆转肝纤维化。HSC已成为研究肝纤维化治疗的主要靶细胞。本研究结果显示莪术油能引起细胞基因组DNA断裂,更进一步证明莪术油能诱导体外HSC发生凋亡。 HSC凋亡是一个受基因调控的主动过程,可能由若干相关基因共同完成。与HSC的凋亡有密切关系的基因有Bcl-2、Fas/FasL、caspases等。Bcl-2是Bcl家族中的重要成员,为凋亡抑制基因,Bcl-2蛋白存在于细胞中的线粒体膜且主要定位线粒体外膜PT孔[4-5]。一旦细胞受到凋亡因子的诱导,Bcl-2向线粒体转位通过寡聚化在线粒体外膜形成跨膜通道,或开启线粒体PT孔,导致线粒体中的凋亡因子释放,激活 caspase,导致细胞凋亡[4,6]。 Fas(又称APO-1)及其配体FasL是肿瘤坏死因子受体的超家族成员,Fas和FasL被认为是细胞凋亡的诱导因子,在细胞发生凋亡时,Bcl-2 mRNA转录水平显著降低,APO-1系统诱导的凋亡过程是通过Bcl-2表达的负调控Fas来实现的[7]。Fas蛋白与FasL结合后激活caspase,启动caspases的级联反应,导致靶细胞凋亡[8]。在HSC细胞凋亡过程中caspase家族起着重要作用,其中caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的不可替代的终末剪切酶,在凋亡的早期阶段,细胞色素C从线粒体释放,继而伴caspases激活,活化的caspase-3被裂解相应的胞质胞核底物而激活核酸酶,从而降解DNA,最终导致细胞凋亡[9]。 本研究结果显示,药物作用组的细胞Fas/FasL基因表达上调,Bcl-2表达下调,caspase-3蛋白表达增加,与对照组相比有显著的差异,且呈浓度与时间依赖性。提示其诱导HSC-T6细胞凋亡的机制可能与Fas/FasL、Bcl-2基因和caspase-3蛋白通过线粒体凋亡途径有关系。可能是通过上调促凋亡基因Fas/FasL的表达,下调抑凋亡基因Bcl-2的表达,使线粒体通透性增加,链锁激活caspase-3蛋白,而导致细胞凋亡。在莪术油诱导HSC-T6细胞凋亡的作用机制中是否还存在其他凋亡途径、细胞凋亡相关基因或因子有待进一步研究。 参 考 文 献 [1]You H, Wang BE, Wang TL, et al. Proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells and effects of compound 861 on liver fibrosis. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2000, 8: 78-80. (in Chinese) 尤红,王宝恩,王泰龄,等.复方861对肝星状细胞的增殖和凋亡的干预作用.中华肝脏病杂志,2000,8:78-80. [2]Zheng S, Chen A. Curcumin suppresses the expression of extracellular matrix genes in activated hepatic stellate cells by inhibiting gene expression of connective tissue growth factor. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2006, 290: G883-893. [3]Guo Y, 国艳,彭安邦,廖爱军,等.莪术油注射液对肝星状细胞增殖、凋亡及分泌细胞外基质的影响.中华肝脏病杂志,2008,16:302-303. [4]Herrmann JL, Bruckheimer E, McDonnell TJ. Cell death signal transduction and Bcl-2 function. Biochem Soc Trans, 1996, 24: 1059-1065. [5]Murphy E, Imahashi K, Steenbergen C. Bcl-2 regulation of mitochondrial energetics. Trends Cardiovasc Med, 2005, 15: 283-290. [6]Shimizu S, Kanaseki T, Mizushima N, et al. Role of Bcl-2 family proteins in a non-apoptotic programmed cell death dependent on autophagy genes. Nat Cell Biol, 2004, 6: 1221-1228. [7]Novo E, Marra F, Zamara, et al. Overexpression of Bcl-2 by activated human hepatic stellate cells: resistance to apoptosis as a mechanism of progressive hepatic fibrogenesis in humans. Gut, 2006, 55: 1174-1182. [8] 易铁男,周云峰,伍钢.Caspase家族与细胞凋亡的研究进展.国外医学肿瘤学分册,2001,28:39-42. [9]Takahashi A. caspase: executioner and undertaker of apoptosis. Int J Hematol, 1999, 70: 226-232.
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