【摘要】 目的 探讨肝癌细胞株HepG2细胞间是否存在P-糖蛋白（P-gp）的传递及P-gp与多药耐药基因(mdr1)的关系。 方法 将pSUPER.neo+GFP质粒转染至HepG2细胞（命名为HepG2/GFP），并与阿霉素耐药HepG2细胞（命名为HepG2/ADM）混合培养。激光共聚焦显微镜观察肝癌细胞间P-gp的传递。免疫磁珠法分离混合培养细胞，收集原HepG2/GFP细胞（命名为HepG2/aqMDR），采用Western blot分析HepG2、HepG2/ADM、HepG2/GFP、HepG2/aqMDR细胞的P-gp表达水平，同时应用实时荧光定量PCR分析这些细胞mdr1 mRNA的表达水平。多样本均数比较用单因素方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验。 结果 荧光显微镜下可见大量带绿色荧光的稳定克隆。激光共聚焦显微镜下见HepG2/aqMDR细胞以黄色荧光为主，而HepG2/GFP以绿色荧光为主，HepG2/ADM以红色荧光为主。Western blot检测结果显示HepG2/aqMDR细胞中P-gp表达水平低于HepG2/ADM，但明显高于HepG2/GFP（q＝35.07，P＜0.05）与HepG2（q＝36.87，P＜0.05）。实时荧光定量PCR结果显示，HepG2/ADM细胞中mdr1 mRNA表达水平较高，而HepG2/aqMDR、 HepG2、HepG2/GFP三组细胞中mdr1的mRNA表达水平差异没有统计学意义（F＝2.30，P＞0.05）。 结论 P-gp可以从耐药肝癌细胞传递至敏感肝癌细胞，这一现象为进一步研究肝癌多药耐药机制提供了新的思路。 【关键词】 癌，肝细胞； P糖蛋白； 基因，MDR； 抗药性，多药 Intercellular transfer of P-glycoprotein in hepatocellular cell line HepG2 CHEN Long, ZUO Guo-qing, WU Jin-feng, ZENG Gui-li, LI Tao, LIU Zuo-jin, TANG Kai-fu. Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital, Corresponding author: ZUO Guo-qing, Email: cqzgqly@ 163.com 【Abstract】 Objective To investigate whether there is intercellular transfer of functional P-glycoprotein(P-gp) from P-gp-positive cells to P-gp-negative cells in vitro. Methods HepG2/GFP cells, a HepG2 cell line stably expressing GFP, were co-cultured with HepG2/ADM cells, an adriamycin-resistant cell line derived from HepG2 cells. The distribution of P-gp in hepatocellular carcinoma cell was observed under laser scanning confocal microscope (LSCM). Immunomagnetic beads were used to separate HepG2/GFP cells from the mixed culture. The abundance of P-gp was analyzed by western blot, and the expression of mdr1 mRNA was detected by qRT-PCR. Results Yellow fluorescence was detected in HepG2/aqMDR cells, green fluorescence was detected in HepG2/GFP cells, red fluorescence was detected in HepG2/ADM cells by LSCM. The level of P-gp protein in HepG2/aqMDR cells was lower than that in HepG2/ADM cells, but higher than that in HepG2/GFP cells (q = 35.07, P < 0.05) and HepG2 cells (q = 36.87, P < 0.05). The expression of mdr1 mRNA in HepG2/ADM cells was higher than that in HepG2/aqMDR, HepG2 and HepG2/GFP cells, but there was no significant difference in mdr1 mRNA among HepG2/aqMDR, HepG2 and HepG2/GFP cells (F = 2.30, P > 0.05). Conclusions P-gp can transfer from drug resistant hepatocellular cells to sensitive hepatocellular carcimoma cells. This study suggests a novel mechanism of multidrug resistance in hepatocellular carcimoma. 【Key words】Carcinoma, hepatocellular; P-glycoprotein; Genes, mdr; Drug resistance, multiple 多药耐药基因（multipledrug resistance gene 1，mdr1）编码的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）属三磷酸腺苷依赖性转运蛋白超家族成员，为具有泵功能的跨膜蛋白，能利用自身分解三磷酸腺苷产生的能量，将进入细胞内的药物泵出细胞，以减少细胞内药物潴留，降低细胞内的药物浓度，从而介导肿瘤细胞产生多药耐药性（multipledrug resistance，MDR）[1]。肿瘤细胞的MDR是困扰临床肿瘤化学疗法的主要障碍。近年，Sloan-Kettering癌症中心和Johns Hopkins大学研究人员发现，P-gp能够在神经母细胞瘤细胞间转移并保留其生物学活性而不依赖于基因水平的表达[2]。因此，本研究选择对阿霉素敏感的人肝癌细胞株HepG2细胞以及对阿霉素耐药的HepG2/ADM细胞为靶细胞，在体外观察肝癌细胞间是否也存在P-gp的传递，以及探讨P-gp和mdr1的关系。旨在为进一步逆转肿瘤细胞MDR做初步探索。 材料与方法 1. 试剂：RPMI 1640培养液和小牛血清购自美国Gibco公司；脂质体Lipofectmine2000和细胞总RNA提取试剂盒Trizol购自美国Invitrogen公司；小量质粒提取试剂盒购自美国Omega公司；荧光标记实时定量PCR试剂盒购自日本Toyobo公司；小鼠抗-P-gp单克隆抗体、小鼠抗-绿色荧光蛋白（GFP）单克隆抗体、山羊抗-小鼠IgG均购自武汉博士德公司。磁珠偶联的山羊抗小鼠IgG购自美国New England Biolabs。pSUPER.neo+GFP质粒保存于重庆医科大学病毒性肝炎研究所。β-肌动蛋白和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）购自立陶宛Fermentas公司。其他化学试剂均为国产分析纯试剂。 2. 细胞：人肝癌细胞株HepG2细胞保存于重庆医科大学病毒性肝炎研究所；人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM购自重庆医科大学超声医学研究所。在 3. pSUPER.neo+GFP质粒转染HepG2细胞：在6孔板中常规培养HepG2细胞至融合度90%，按照lipofectamine 2000 (Invitrogen) 的转染方案将pSUPER.neo+GFP质粒转染至HepG2细胞中；转染后24h将细胞传代至直径为 4. 激光共聚焦显微镜观察细胞间P-gp的传递：在24孔板中按1∶1的比例混合培养HepG2/GFP与HepG2/ADM细胞，待细胞爬片至融合度90%，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，加入4%多聚甲醛+0.5% Triton-X-100-PBS固定15min；加入1%牛血清白蛋白+0.5% Triton-X-100-PBS封闭30min；加入小鼠抗-P-gp单克隆抗体， 5. 免疫磁珠分离混合培养细胞：HepG2/ADM及HepG2/GFP细胞混合培养10d，收集细胞，PBS洗3次；加入小鼠抗-GFP单克隆抗体， 6. Western blot分析P-gp蛋白表达水平：分别收集HepG2/aqMDR、HepG2、HepG2/ADM及HepG2/GFP细胞，PBS洗3次；加入裂解液［1.5mol/L Tris HCl（pH 8.0）、1mol/L NaCl、0.5mol/L乙二胺四乙酸钠、10%十二烷基硫酸钠］和苯甲基磺酰氟（二者比例按10∶1）， 7. 实时荧光定量PCR分析mdr1的mRNA表达水平：在6孔板中分别培养HepG2/aqMDR、HepG2、HepG2/ADM及HepG2/GFP细胞，按Invitrogen公司RNA抽提试剂盒说明书抽提每种细胞总RNA，以GAPDH作为内参照。 8. 统计学分析：实验结果用均数±标准差（x-±s）表示，用SPSS13.0统计分析软件进行统计分析。多样本均数比较用单因素方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。 结 果 1. pSUPER.neo+GFP质粒转染HepG2细胞：将pSUPER.neo+GFP质粒转染至HepG2细胞中,并用含500μg/ml G418的完全培养液稳定筛选后，在荧光显微镜下可见大量含绿色荧光的细胞，即HepG2/GFP细胞（图1）。说明pSUPER.neo+GFP质粒在HepG2细胞中稳定表达，HepG2/GFP细胞克隆成功。 2. 激光共聚焦显微镜观察细胞间P-gp的传递：激光共聚焦显微镜下，HepG2/GFP细胞以绿色荧光为主，HepG2/ADM细胞以红色荧光为主，而在混合培养的细胞中，获得P-gp的HepG2/GFP细胞，即HepG2/aqMDR细胞则以黄色荧光为主（图2）。说明HepG2/GFP细胞在与HepG2/ADM细胞混合培养后P-gp的表达水平上调，变为HepG2/aqMDR细胞。 3.Western blot分析P-gp的表达水平：HepG2/aqMDR、HepG2、HepG2/GFP细胞中P-gp表达水平分别约为HepG2/ADM细胞的76.53%±5.34%、24.38%±4.41%、26.93%±3.58%（图3），各细胞中P-gp表达水平差异有统计学意义 (F＝425.92，P＜0.05)。其中，HepG2/aqMDR中P-gp表达水平明显高于HepG2（q＝36.87，P＜0.05）和HepG2/GFP（q＝35.07，P＜0.05）；而HepG2和HepG2/GFP细胞的P-gp表达水平差异无统计学意义 (q＝1.80，P＞0.05)。 4. 实时荧光定量PCR分析mdr1的mRNA表达水平：HepG2/aqMDR、HepG2、HepG2/GFP细胞mdr1的mRNA表达水平分别约为HepG2/ADM的24.08%±4.38%、20.91±4.30%、25.17±4.78%。HepG2/aqMDR、HepG2、 HepG2/GFP三种细胞mdr1的mRNA表达水平差异没有统计学意义（F＝2.30，P＞0.05）。 讨 论 化学疗法在预防肝癌术后肿瘤复发和转移中发挥着不可替代的作用。但随着治疗时间的延长，肿瘤细胞将逐渐产生MDR现象，这成为导致肝癌化学疗法失败的主要原因[1]。因此，逆转肿瘤细胞MDR现象成为肝癌化学疗法能否取得突破性进展的关键。 肿瘤的发生并非来源于单个细胞癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活，而是多克隆性的，这就决定了肿瘤细胞间的“异质性”[3]。逃避机体免疫监视是肿瘤细胞存活的前提条件，而表达较高水平 “肿瘤特异性抗原”的细胞则易于被免疫细胞清除[4]。同样，在化学疗法药物的“选择压力”下，敏感的肿瘤细胞较早地被杀灭，存活的细胞则逐渐上调其mdr1基因的转录和P-gp的表达水平。这是肿瘤细胞在较高浓度化学疗法药物毒性作用下的“生存之道”[5]。我们在前期研究中观察到，在阿霉素分级诱导HepG2细胞多药耐药过程中，随着培养时间的延长和阿霉素浓度的增加，HepG2细胞mdr1基因的转录水平和P-gp的表达水平均明显提高[6]。 细胞间存在多种形式的信息交换，可使同类型细胞或与其他细胞（如基质细胞、血管内皮细胞等）达成某种程度的共性，以“群体优势”更好地适应周围环境的改变[7]。本研究结果显示，P-gp蛋白能够在肝癌细胞间转移。在体外与P-gp阳性肿瘤细胞共同培养一定时间后，可在敏感肿瘤细胞中检测到P-gp的高水平表达，从而对化学疗法药物产生耐药性，但其mdr1基因转录水平并未明显上调。同时，每个敏感细胞所获得的P-gp水平是不等的，呈聚集分布。当其中一个肿瘤细胞在化学疗法药物的诱导下先产生耐药性、高表达P-gp时，它将先传递给邻近的肿瘤细胞，使其对化学疗法药物也产生耐药性；以此类推，P-gp将由近及远地在细胞间进行传递，使一定范围内的肿瘤细胞在较短时间内高水平表达P-gp，以“群体优势”应对抗癌药物，产生耐药性。这也提示，探讨细胞间P-gp的相互传递机制，对于逆转肿瘤细胞的耐药性具有重要意义。 肝癌对多种抗癌药物欠敏感，免疫组织化学染色和RT-PCR检测到肝癌手术切除标本中P-gp蛋白和mdr1基因高表达[8]。针对肿瘤MDR，国内外不少学者已进行了大量研究，在基因水平阻断mdr1的转录和翻译成为多数研究者努力的方向。然而，P-gp在肿瘤细胞间的传递不依赖mdr1基因的转录，使单纯基因治疗逆转其MDR成为难点。梅英等[9]的研究结果表明，在体外诱导的高耐药HepG2细胞株，以腺病毒携带mdr1反义基因进行干预，腺病毒在细胞的转染效率接近100%，而对细胞MDR的逆转作用却不到40%，效果并不十分令人满意；进而，在动物实验中，以高耐药HepG2细胞裸鼠皮下接种成瘤，在化学疗法的同时辅以腺病毒注射，同样难以有效地逆转肿瘤细胞的MDR，瘤细胞P-gp表达水平的下降程度远低于mdr1基因转录水平的下降程度。同样，本研究结果也证实了这一点，也为深入探讨肝癌的MDR现象提供了新的思路。下一步，我们将对P-gp在肿瘤细胞间的传递机制进行探索，这对于逆转MDR具有重要的理论和现实意义。 参 考 文 献 [1]Takara K, Sakaeda T, Okumura K. 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